Summary

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Published: February 10, 2017
doi:

Summary

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Abstract

Nella malattia di Parkinson (PD) non vi è perdita neuronale diffusa in tutto il cervello con degenerazione dei neuroni dopaminergici pronunciata nel snc, che porta a bradicinesia, rigidità, e tremore. L'identificazione dei neuroni dopaminergici che vivono in colture primarie ventrale mesencefalica (VM) utilizzando un marcatore fluorescente fornisce un modo alternativo per studiare la vulnerabilità selettiva di questi neuroni senza fare affidamento sul immunocolorazione delle cellule fissate. Qui, isolare, dissociamo, e la cultura di topo neuroni VM per 3 settimane. Abbiamo poi identifichiamo neuroni dopaminergici nella coltura usando eGFP fluorescenza (guidata da un promotore tirosina idrossilasi (TH)). neuroni individuali sono raccolte in provette da microcentrifuga utilizzando micropipette di vetro. Successivamente, abbiamo la lisi delle cellule raccolte, e condurre la sintesi del DNA e trasposoni-mediata "tagmentation" per produrre librerie di RNA-Seq singola cella 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Dopo aver superato un controllo di qualità-controllo, librerie unicellulari sono in sequenza e la successiva analisi viene effettuata per misurare l'espressione genica. Riportiamo i risultati trascrittoma per dopaminergici individuale e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici. Queste tecniche avranno applicazioni diffuse nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.

Introduction

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa incurabile, legate all'età. La causa di questo disturbo relativamente comune rimane poco compresa. Vi è diffusa perdita neuronale in tutto il cervello, con marcata degenerazione neuronale dei neuroni dopaminergici nella sostanza nera (SNC), che porta a caratteristiche cliniche diagnostiche di bradicinesia, rigidità e tremori.

colture miste primarie contenenti neuroni dopaminergici SNC sono particolarmente rilevanti per la malattia di Parkinson. Ventrale tegmentale Area (VTA) neuroni dopaminergici sono stati implicati nella ricompensa e la dipendenza. Ventrale mesencefalico (VM) colture primarie embrionali miste contengono sia i neuroni SnC e VTA dopaminergici (DA) e neuroni GABAergici. VM colture primarie possono essere utili per saggi neuroprotezione e per chiarire la vulnerabilità selettiva dei neuroni dopaminergici. Non vi è alcun modo affidabile per identificare le cellule dopaminergiche in coltura basati sulla morfologia. luire sviluppiamo tecniche per identificare e raccogliere i neuroni dopaminergici singoli, e costruire unicellulari, ad alto rendimento librerie RNA di sequenziamento.

Riportiamo i dati rappresentativi RNA trascrittoma per singola dopaminergici e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Questo protocollo può essere utilizzato per la neuroprotezione, neurodegenerazione, e saggi farmacologici per studiare gli effetti dei vari trattamenti sul trascrittoma DA / GABA. Perché neuroni dopaminergici rappresentano una piccola minoranza dei neuroni espresse in colture primarie VM, la capacità di identificare in modo affidabile questi neuroni in culture che vivono consentirà una maggiore gamma di studi unicellulari. Queste nuove tecniche faciliteranno progressi nella comprensione dei meccanismi che si svolgono a livello cellulare e possono avere applicazioni altrove nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali forniti dal National Institutes of Health, e protocolli sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso il California Institute of Technology. 1. Derivazione di primaria dopaminergici colture cellulari da Brain embrionali di topo Soluzioni e terreno di coltura Preparazione di Acido Ascorbico della Soluzione Pesare…

Representative Results

Qui riportiamo un protocollo per la coltura neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotrice tirosina idrossilasi, raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando la loro trascrittoma RNA utilizzando RNA-seq (Figura 1). I dati mostrano che il 100% delle cellule TH-eGFP-positivi che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-cor…

Discussion

Qui si isolare le cellule singole da una popolazione eterogenea con un tag fluorescenti, quindi studiare ogni cella con cella singola RNA-Seq. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che abbiamo raccolto e sequenziati erano neuroni dopaminergici infatti, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-correlati, TH, DDC e slc6a3. Tutte le cellule positive TH-eGFP espresso questi tre geni come valutato dal RNA-Seq. Questo è stato concorde con gli studi elettrofisiologici che hanno dimostrato che …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

References

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

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Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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