Summary

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Published: February 10, 2017
doi:

Summary

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Abstract

Bei der Parkinson-Krankheit (PD) ist weit verbreitet Verlust von Neuronen im Gehirn mit ausgeprägter Degeneration dopaminerger Neurone in der SNc, was zu Bradykinesie, Rigidität und Tremor. Die Identifizierung von lebenden dopaminergen Neuronen in der primären ventrale mesencephalen (VM) Kulturen einen fluoreszierenden Marker bietet eine alternative Möglichkeit die selektive Anfälligkeit dieser Neuronen, ohne sich auf die Immunfärbung von fixierten Zellen zu studieren. Hier isolieren wir distanzieren und Kultur Maus VM Neuronen für 3 Wochen. Wir identifizieren dann dopaminergen Neuronen in den Kulturen mit eGFP-Fluoreszenz (angetrieben von einem Tyrosin-Hydroxylase (TH) Promotor). Einzelne Neuronen werden in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von Glasmikropipetten geerntet. Als nächstes wir die geernteten Zellen lysieren und cDNA – Synthese und Transposon-vermittelte "tagmentation" leiten einzelne Zelle RNA-Seq – Bibliotheken 1, 2, zu erzeugen ,ass = "xref"> 3, 4, 5. Nach dem Passieren wird eine Qualitätskontrollprüfung werden Einzelzellen-Bibliotheken sequenziert und die anschließende Analyse durchgeführt Genexpression zu messen. Wir berichten Transkriptom Ergebnisse für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die geerntet wurden und sequenziert wurden dopaminergen Neuronen. Diese Techniken haben weit verbreitete Anwendungen in der Neurowissenschaft und Molekularbiologie.

Introduction

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung. Die Ursache für diese relativ häufige Erkrankung bleibt kaum verstanden. Es ist weit verbreitet Neuronenverlust im gesamten Gehirn, mit ausgeprägter neuronaler Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SNC), was zu einem diagnostischen klinischen Merkmale der Bradykinesie, Rigor und Tremor.

Primäre Mischkulturen SNc dopaminergen Neuronen enthalten, sind besonders relevant für die Parkinson-Krankheit. Ventralen Tegmentum (VTA) dopaminergen Neuronen wurden in Lohn und Sucht beteiligt. Ventrale mesencephalen (VM) primären gemischten embryonalen Kulturen enthalten sowohl SNc und VTA dopaminergen (DA) Neuronen und GABAergen Neuronen. VM Primärkulturen können für Neuroprotektion Assays nützlich sein und die selektive Anfälligkeit von dopaminergen Neuronen aufzuklären. Es gibt keine zuverlässige Möglichkeit, dopaminergen Zellen in Kultur, die auf Morphologie zu identifizieren. ErSingle-Cell, High-Yield-RNA-Sequenzierung Bibliotheken re entwickeln wir Techniken einzelne dopaminergen Neuronen zu identifizieren und zu ernten, und zu konstruieren.

Wir berichten Vertreter RNA Transkriptom-Daten für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Dieses Protokoll kann für Neuroprotektion, Neurodegeneration und pharmakologische Tests verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Behandlungen auf dem DA / GABA Transkriptom zu studieren. Da dopaminergen Neuronen eine kleine Minderheit der exprimierten Neuronen in der primären VM Kulturen repräsentieren, die Fähigkeit, zuverlässig diese Neuronen in lebenden Kulturen identifizieren eine erweiterte Palette von Single-Cell-Studien ermöglichen. Diese neuen Techniken werden Fortschritte erleichtern, die Mechanismen zu verstehen, Platz auf der zellulären Ebene und Anwendungen an anderer Stelle in den Bereichen der Neurowissenschaften und Molekularbiologie haben.

Protocol

HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durch die National Institutes of Health durchgeführt und Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am California Institute of Technology genehmigt. 1. Ableitung der primären dopaminergen Zellkulturen von embryonalen Mäusegehirn Lösungen und Kulturmedium Herstellung von Ascorbinsäure-Stammlösung Man wiegt 352 mg Ascor…

Representative Results

Hier berichten wir ein Protokoll zur Kultivierung ventralen Mesencephalon – Neuronen von einem Maus – eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase – Promotor – Sequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen und Messung ihrer RNA Transkriptom unter Verwendung von RNA-seq (Abbildung 1). Die Daten zeigten, dass 100% der TH-eGFP-positive Zellen, die geerntet wurden und dopaminergen Neuronen wurden sequenziert, basierend auf der Anwesenheit…

Discussion

Hier isolieren wir einzelne Zellen aus einer heterogenen Population einen Fluoreszenzmarker verwenden, dann jede Zelle studieren mit Single-Cell-RNA-seq. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die wir waren tatsächlich dopaminergen Neuronen geerntet und sequenziert, basierend auf der Anwesenheit der folgenden drei DA-verwandtes Gen-Transkripte, TH, DDC und SLC6A3. Alle der TH-eGFP positiven Zellen, die diese drei Gene exprimiert durch RNA-Seq beurteilt wie. Das war konkordant mit elektrophysiologischen S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

References

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

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Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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