السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد
Summary
هنا، نحن تصف نماذج الزرد طعم أجنبي باستخدام اثنين من مواقع الحقن المختلفة، أي الفضاء المحيط بالمح والقناة كوفييه، للتحقيق في السلوك العدواني وتقييم دخول الوعاء والتسرب إمكانات خلايا سرطان الثدي البشرية، على التوالي.
Abstract
في كثير من الحالات، ومرضى السرطان لا يموت من الورم الرئيسي، وإنما بسبب ورم خبيث. وعلى الرغم من العديد من نماذج القوارض المتاحة لدراسة سرطان خبيث في الجسم الحي، وهناك حاجة موثوق بها، ونماذج أخرى فعالة ومنخفضة التكلفة بسرعة للوصول إلى الآثار المحتملة ل(برنامج التحصين الموسع) التغيرات الجينية أو المركبات الدوائية. على هذا النحو، نحن لتوضيح وشرح جدوى نماذج طعم أجنبي باستخدام خلايا سرطان الثدي البشرية تحقن الأجنة الزرد لدعم هذا الهدف. تحت المجهر، وزرع البروتينات الفلورية أو المسمى كيميائيا خلايا سرطان الثدي البشري في الأجنة الزرد المعدلة وراثيا، تيراغرام (FLI: EGFP)، على مساحة محيط بالمح أو القناة كوفييه (الوثيقة) 48 ساعة بعد الإخصاب. بعد ذلك بوقت قصير، هو تصور عملية الزمانية والمكانية من غزو الخلايا السرطانية، ونشر، والانبثاث في الجسم الأسماك التي تعيش تحت المجهر الفلورسنت. النماذج باستخدام مواقع الحقن المختلفة، أي فيمساحة ivitelline أو الوثيقة مكملة لبعضها البعض، الأمر الذي يعكس مرحلة مبكرة (خطوة دخول الوعاء) والمرحلة المتأخرة (التسرب خطوة) من سلسلة النقيلي متعددة الخطوات للأحداث. وعلاوة على ذلك، الأوعية الدموية peritumoral وintratumoral يمكن ملاحظة مع الحقن في الفضاء محيط بالمح. الفترة التجريبية كلها لا يزيد عن 8 أيام. هذين النموذجين الجمع بين العلامات الخلية، وزرع الصغير، وتقنيات التصوير مضان، مما يتيح للتقييم السريع لالانبثاث سرطان ردا على التلاعب الجيني والدوائية.
Introduction
ويضم العلني الانبثاث سرطان في العيادة سلسلة من الأحداث المعقدة ومتعددة الخطوات المعروفة باسم "سلسلة النقيلي". وقد استعرضت شلال على نطاق واسع، ويمكن تشريح في خطوات متتالية: غزو المحلي، دخول الوعاء، ونشر واعتقال والتسرب، والاستعمار 1 و 2. فهم أفضل من التسبب في الانبثاث السرطان وتطوير استراتيجيات علاجية محتملة في الجسم الحي تتطلب نماذج المضيف قوية من انتشار الخلايا السرطانية. يتم وضع نماذج القوارض جيدا وتستخدم على نطاق واسع لتقييم الانبثاث 3، ولكن هذه الأساليب يكون انخفاض كفاءة والقيود الأخلاقية ومكلفة كنموذج طليعة لتحديد ما إذا كان التلاعب معين يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري النقيلي. وهناك حاجة إلى نماذج أخرى موثوق بها منخفضة التكلفة الفعالة وبسرعة للوصول إلى الآثار المحتملة ل(برنامج التحصين الموسع) التغيرات الجينية أو pharmacologمركبات كال. ظهرت بسبب التماثل الجيني عالية على البشر وشفافية من الأجنة الزرد (دانيو rerio) نموذجا الفقاريات المهم ويجري تطبيقها على نحو متزايد لدراسة العمليات التنموية، والتفاعلات الميكروب المضيف، الأمراض التي تصيب الإنسان، وفحص المخدرات وغيرها 4. نماذج سرطان خبيث أنشئت في الزرد قد توفر إجابة على أوجه القصور في نماذج القوارض 5، 6.
على الرغم من أن الأورام عفوية ويعتبر نادرا في الزرد البرية 7، وهناك العديد من التقنيات التي طال أمدها للحث على السرطان المطلوب في الزرد. الطفرات الجينية الناجمة عن مادة مسرطنة أو يشير تفعيل مسار يمكن تشريحيا وجزيئيا التسرطن النموذج، ومحاكاة الأمراض التي تصيب البشر في الزرد 7 و 8 و 9. بواسطة تاكجي الاستفادة من التنوع إلى الأمام وعكس التلاعب الجيني من الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم، (وراثيا) الزرد مكنت أيضا دراسات المحتملة لتشكيل السرطان وصيانة 6 و 10. نماذج السرطان يتسبب في الزرد تغطي طائفة واسعة، بما في ذلك الجهاز الهضمي، التناسلي، والدم، والجهاز العصبي، والظهارية 6.
وسعت الاستفادة من الزرد في أبحاث السرطان في الآونة الأخيرة نظرا لإنشاء نماذج الخلايا السرطانية طعم أجنبي الإنسان في هذا الحي. جاء ذلك أولا مع خلايا سرطان الجلد المنتشر الإنسان التي المغروسة بنجاح في الأجنة الزرد في مرحلة الأريمة في عام 2005 (11). والتحقق من صحة عدة مختبرات مستقلة جدوى هذا العمل الرائد من خلال تقديم مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا السرطانية الثديية في الزرد في مواقع مختلفة ومراحل نمو 5 </ سوب>. على سبيل المثال، والحقن بالقرب من blastodisc والكيسة المرحلة الأريمة. الحقن في الكيس المحي، الفضاء المحيط بالمح، قناة كوفييه (الوثيقة)، والخلفي الوريد الكاردينال 6-ح- إلى الأجنة القديمة لمدة 5 أيام؛ وحقن في التجويف البريتوني اليرقات كبت المناعة عمرها 30 يوما، وقد تم تنفيذ 5، 12. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن زرع الورم خيفي أيضا في الزرد 12 و 13. واحدة من مزايا كبيرة لاستخدام xenografts هو أن الخلايا السرطانية المغروسة يمكن أن يكون بسهولة fluorescently المسمى ومميز من الخلايا الطبيعية. وبالتالي، تحقيقات في سلوك دينامية من تشكيل microtumor 14، غزو الخلايا والانبثاث 15، 16، 17، الناجم عن ورم الأوعية الدموية 15، 1 8، والتفاعلات بين الخلايا السرطانية والمضيف عوامل 17 يمكن تصور بوضوح في جسم السمكة الحية، وخاصة عندما يتم تطبيق خطوط الزرد المعدلة وراثيا 5.
مستوحاة من إمكانات عالية من النماذج طعم أجنبي الزرد لتقييم ورم خبيث، أثبتنا خصائص التسرب transvascular من مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي في منطقة tailfin تيراغرام (FLI: EGFP) الأجنة الزرد عن طريق الحقن الوثيقة 16. دور عامل النمو المحول-β (TGF-β) بروتين 16 و العظام مخلق (BMP) وتم التحقيق 19 مسارات إشارات في غزو الخلايا السرطانية الموالية / مكافحة سرطان الثدي وورم خبيث أيضا في هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا لخص القدرة دخول الوعاء مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي في التداول باستخدام نماذج الزرد طعم أجنبي مع حقن الفضاء المحيط بالمح.
<p class = "jove_content"> تقدم هذه المقالة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لنماذج طعم أجنبي الزرد استنادا إلى حقن خلايا سرطان الثدي البشرية في الفضاء محيط بالمح أو الوثيقة. باستخدام عالية الدقة التصوير مضان، وتبين لنا عملية تمثيلية للدخول الوعاء في الأوعية الدموية والسلوك العدواني من مختلف خلايا سرطان الثدي البشرية، والتي تتحرك من الأوعية الدموية في منطقة tailfin اوعائية.Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا طريقتين للتحقيق في السلوك العدواني من خلايا سرطان الثدي في تيراغرام (fli1: EGFP) الأجنة الزرد، مع حقن مساحة محيط بالمح وثيقة. عن طريق حقن الخلايا السرطانية التي تحمل صبغة كيماوية أو البروتين الفلوري في الأجنة الزرد المعدلة وراثيا، وخصائص ديناميكية والمكا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم دراسات على أفراد الأسرة TGF بيتا من السرطان الجينوم المركز الهولندي. معتمدة سيجيا ليو جيانغ ورن من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني لمدة 4 سنوات من الدراسة في جامعة ليدن. نشكر الدكتور فريد ميلر (معهد السرطان كارمانوس آن باربرا، ديترويت، MI، الولايات المتحدة الأمريكية) للخطوط الخلايا MCF10A.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
