Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling
Summary
Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.
Abstract
In vielen Fällen Krebspatienten sterben nicht von einem Primärtumor, sondern wegen der Metastasierung. Obwohl zahlreiche Nagetiermodelle zur Untersuchung von Krebsmetastasen in vivo zur Verfügung stehen, andere effizient, zuverlässig, sind Low-Cost – Modelle benötigt , um schnell die möglichen Auswirkungen von (epi) genetischen Veränderungen oder pharmakologischer Verbindungen zugreifen. Als solche wir veranschaulichen und die Machbarkeit der Xenograftmodellen mit menschlichen Brustkrebszellen injiziert in Zebrabärblingembryonen erklären, dieses Ziel zu unterstützen. Unter dem Mikroskop sind in transgene Zebrafischembryonen transplantiert fluoreszierende Proteine oder chemisch markierte menschliche Brustkrebszellen, Tg (FLI: EGFP), am perivitellinen Raum oder Kanal Cuviers (DOC) 48 h nach der Befruchtung. Kurz darauf der räumlich-zeitliche Prozess der Invasion von Krebszellen, die Verbreitung und die Metastasierung im lebenden Fischkörper wird unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Modelle mit unterschiedlichen Injektionsstellen, dh proivitelline Raum oder Doc ist komplementär zueinander, was das frühe Stadium (intravasation Schritt) und Spätstadium (Extravasation Schritt) der vielstufigen metastatischen Kaskade von Ereignissen. Darüber hinaus kann peritumoralen und intratumorale Angiogenese mit der Injektion in den perivitellinen Raum beobachtet werden. Die gesamte Versuchsdauer nicht mehr als 8 Tage. Diese beiden Modelle kombinieren Zellmarkierung, Mikro-Transplantation, und Fluoreszenz-Bildgebungstechniken, ermöglicht die schnelle Auswertung von Krebsmetastasen in Reaktion auf genetische und pharmakologische Manipulationen.
Introduction
Offenkundige Krebsmetastasen in der Klinik weisen eine Reihe von komplexen und mehrstufiges Ereignissen als „metastatic cascade“ bekannt. Die Kaskade wurde ausführlich überprüft und können in aufeinanderfolgende Schritte zerlegt werden: lokale Invasion, intravasation, Verbreitung, Festnahme, Extravasation und Kolonisierung 1, 2. Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Krebsmetastasen und der Entwicklung von möglichen Behandlungsstrategien in vivo erfordert robuste Host – Modelle von Krebszellen zu verbreiten. Nagetiermodelle sind gut etabliert und werden verwendet , weit Metastasierung 3 zu bewerten, aber diese Ansätze haben eine geringe Effizienz und ethische Grenzen und sind teuer als Vordergrund Modell zu bestimmen , ob eine bestimmte Manipulation des metastatischen Phänotyp beeinflussen könnte. Andere effiziente, zuverlässige, kostengünstige Modelle sind notwendig, um schnell die möglichen Auswirkungen des Zugangs (epi) genetische Veränderungen oder pharmacologische Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen genetischen Homologie zu den Menschen und die Transparenz ihrer Embryonen Zebrabärbling (Danio rerio) haben als ein wichtiges wirbel Modell entstanden und zunehmend auf die Untersuchung von Entwicklungsprozessen angewendet werden, mikroben Wirt – Interaktionen, menschliche Krankheiten, Drogen – Screening, etc. . 4. Die Krebsmetastasen Modelle in Zebrabärbling erstellt wurden, können eine Antwort auf die Mängel von Nagetiermodellen bieten 5, 6.
Obwohl spontaner Neoplasie kaum in Wild Zebrabärbling 7 zu sehen ist gibt es mehr Techniken seit langem des gewünschten Krebs in Zebrabärbling zu induzieren. Karzinogen-induzierte Gen – Mutationen oder Signalwegs – Aktivierung können in menschliche Krankheit Zebrabärbling 7, 8, 9 und histologisch molekular Modell des Karzinogenese, nachahmt. durch taking Vorteil von verschiedenen Vorwärts- und Rückwärts genetische Manipulationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, (transgene) Zebrabärbling hat auch potentielle Studien der Krebsentstehung und Wartung 6, 10 aktiviert. Die induzierten Krebsmodelle in Zebrabärbling decken ein breites Spektrum, einschließlich Verdauungs-, Fortpflanzungs-, Blut, Nervensystem, und epithelialen 6.
Die Nutzung von Zebrabärbling in der Krebsforschung hat sich durch die Etablierung von humanen Tumorzell Xenograftmodellen in diesem Organismus vor kurzem erweitert. Dies wurde zuerst mit humanen metastasierenden Melanom – Zellen berichtet , dass im Jahr 2005 11 an dem Blastulastadium in Zebrabärblingembryonen erfolgreich transplantiert wurden. Mehrere unabhängigen Labors haben die Machbarkeit dieser Pionierarbeit validiert durch ein breites Spektrum von Säugetierkrebszelllinien in Zebrabärbling an verschiedenen Standorten und Entwicklungsstadien der Einführung 5 </ Sup>. Zum Beispiel Injektionen in der Nähe der Blastulascheiben und Blastozyste der Blastulastadium; Injektionen in den Dottersack, perivitellinen Raum, Kanal von Cuvier (Doc) und posterioren Kardinalvene von 6-h- bis 5 Tage alten Embryonen; und Injektionen in die Bauchhöhle von 30 Tage alten immunsupprimierten Larven wurden 5 durchgeführt, 12. Zusätzlich wurden allogenen Tumor Transplantationen auch in Zebrabärbling berichtet 12, 13. Einer der großen Vorteile von Xenotransplantaten ist, dass die transplantierten Krebszellen fluoreszenz kann leicht gekennzeichnet und unterscheiden sich von normalen Zellen. Daher Untersuchungen über das dynamische Verhalten von microtumor Bildung 14, Zellinvasion und Metastasierung 15, 16, 17, tumorinduzierte Angiogenese 15, 18, und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Wirtsfaktoren 17 in lebenden Fischen Körper deutlich sichtbar gemacht werden, vor allem , wenn transgene Zebrabärbling Linien 5 angewendet werden.
Angeregt durch das hohe Potential von Zebrabärbling Xenograftmodellen Metastasierung zu bewerten, haben wir gezeigt , die transvaskulärer Extravasation Eigenschaften verschiedener Brustkrebszelllinien in dem tailfin Bereich von Tg (FLI: EGFP) Zebrabärbling – Embryonen durch Doc Injektionen 16. Die Rolle von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 16 und bone morphogenetic protein (BMP) 19 Signalweg in pro- / Anti-Brustkrebs-Zellinvasion und Metastasierung wurden auch in diesem Modell untersucht. Darüber hinaus haben wir rekapituliert auch die intravasation Fähigkeit verschiedener Brustkrebszelllinien in Umlauf Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit perivitellinen Raum Injektionen.
<p class = "„jove_content“"> Dieser Artikel stellt detaillierte Protokolle für Zebrabärbling Xenograftmodellen basiert auf der Injektion von menschlichen Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum oder Doc. Verwendung von hochauflösenden Fluoreszenzabbildung zeigen wir den repräsentativen Prozess der intravasation in Blutgefäße und das invasiven Verhaltens von verschiedenen menschlichen Brustkrebszellen, die aus den Blutgefäßen in den avaskuläre tailfin Bereich bewegen.Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir beschrieben , zwei Methoden , um das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in Tg (FLI1: EGFP) zu untersuchen Zebrabärblingembryonen, mit perivitellinen Raum und Doc – Injektionen. Durch die Injektion mit chemischen Farbstoff markiert Krebszellen oder fluoreszierendem Protein in transgene Zebrafischembryonen, die dynamischen und räumlichen Eigenschaften der Invasion und Metastasierung können deutlich an der Einzelzelle oder Clusterebene unter einem Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit verfolgt we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Untersuchungen an TGF-β-Familie Mitglieder werden vom Cancer Genomics Center Niederlanden unterstützt. Sijia Liu und Jiang Ren werden von der China Scholarship Council für 4 Jahre Studium an der Universität von Leiden unterstützt. Wir danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) für die MCF10A Zelllinien.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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