Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış
Summary
Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.
Abstract
Birçok durumda, kanser hastaları değil, çünkü metastaz, birincil tümörün ölme. Çok sayıda kemirgen modelleri, in vivo kanser metastazı araştırmak için kullanılabilir olsa da, diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya farmakolojik bileşiklerin potansiyel etkilerini erişmek için ihtiyaç vardır. Bunun gibi, biz göstermek ve bu hedefi destekleyecek zebra balığı embriyolarının enjekte insan meme kanseri hücreleri kullanılarak ksenogreft modellerinde fizibilitesini açıklar. Mikroskop altında, floresan proteinleri veya kimyasal olarak etiketli insan meme kanseri hücreleri transgenik zebra balığı embriyolarının transplante edilir, Tg (fli: EGFP), 48 saat sonra, döllenme perivitelline boşluk veya Cuvier (DOC) kanalında. Kısa bir süre sonra, canlı balık vücudunda kanser hücresi invazyonu, yayılması ve metastaz zamansal-mekansal işlem bir floresan mikroskop altında görüntülenmiştir. Yani farklı enjeksiyon yerlerini kullanarak modelleri, başınaivitelline boşluk veya Doküman erken evre (içeri geçiş aşaması) ve geç evre olayları çok aşamalı metastatik kaskad (ekstravazasyon aşaması) yansıtan birbirine tamamlayıcıdır. Ayrıca, tümör çevresi ve tümör anjiyogenez perivitelline bir mekan içine enjekte ile gözlenebilir. Bütün deneysel dönem artık 8 günden daha olduğunu. Bu iki model, genetik ve farmakolojik manipülasyonlara yanıt olarak kanser metastazı hızla değerlendirilmesini sağlayan hücre etiketleme, mikro nakli ve fluoresans görüntü teknikleri birleştirir.
Introduction
Klinikte Aşikar kanser metastazı "metastatik kaskad" olarak bilinen karmaşık ve çok adımlı olaylar serisini içerir. Kaskad yoğun gözden geçirilmiş ve ardışık adımlarla içine disseke edilebilir: lokal invazyon, intravazasyonuna, yayılması, tutuklama, damar genişletme ve sömürgeleştirme 1, 2. Kanser metastazı patogenezinde ve in vivo potansiyel tedavi stratejilerinin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması kanser hücresi yayılmasının sağlam konak modellerini gerektirir. Kemirgen modelleri iyi bilinmekte ve yaygın olarak metastaz 3 değerlendirmek için kullanılır, fakat bu yaklaşım, düşük verimlilik ve etik sınırlamaları vardır ve belirli bir manipülasyon metastatik fenotipi etkileyebilecek olup olmadığını belirlemek için, bir ön planda model olarak yüksek maliyetlidir. Diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya Pharmacolog potansiyel etkilerini erişmek için gerekenik bileşimleri. Onların yüksek genetik insanlara homoloji ve onların embriyolar zebrabalıkları (Danio rerio) şeffaflığı önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır ve gittikçe gelişimsel süreçleri mikrop-konak etkileşimleri, insan hastalıkları, ilaç tarama, vb çalışmalarına uygulanıyor . 4. Zebrabalıkları kurulan kanser metastazı modelleri kemirgen modellerinde 5, 6 eksiklikleri bir cevap verebilir.
Spontan neoplazi güçlükle vahşi zebrabalıkları 7'de görüldüğü halde, zebrafish istenen kanserini tetiklediği birçok sürüncemeli teknikler vardır. Karsinojen indüklenen gen mutasyonu veya sinyal yolunun aktivasyonu histolojik ve moleküler modeli karsinogenez, zebra balığı 7, 8, 9, insan hastalığı taklit edebilir. tak byonkogen veya tümör bastırma genetik manipülasyonlar ileri çeşitli olanaklar ing ve ters (transjenik) zebra balığı, kanser gelişimi ve kuvvetli 6, 10 potansiyel çalışmaları sağlamıştır. Zebrabalıkları indüklenen kanser modelleri sindirim, üreme, kan, sinir sistemi ve 6 epitel dahil geniş bir yelpazede kapsar.
Kanser araştırmalarında zebrabalıkları kullanımı nedeniyle bu organizmada insan tümör hücre ksenogreft modellerinde kurulmasına son zamanlarda genişledi. Bu, ilk başarılı 2005 11 Blastula aşamasında zebra balığı embriyolarının engrafted edildi insan metastatik melanom hücreleri ile bildirilmiştir. Birkaç bağımsız laboratuarlar çeşitli siteler ve gelişim aşamalarında zebrafish içine memeli kanser hücresi hatlarının çok çeşitli tanıtarak bu öncü çalışmanın fizibilite valide var 5 </ Sup>. Örneğin, blastodisc ve Blastula aşamasının blastosist yakınındaki enjeksiyonu; 5-günlük embriyolar yolk kesesi, perivitelline alan, Cuvier'in (DOC) kanalı, ve 6-h arka ana damar içine enjeksiyonlar; 30 günlük bir bağışıklık larvalarının periton boşluğuna enjeksiyonu, 12 5 gerçekleştirilmiştir. Buna ek olarak, allojenik tümör nakilleri de zebrabalıkları 12, 13 bildirilmiştir. ksenogreftlerı kullanmanın büyük avantajlarından biri nakledilmiş kanser hücreleri kolayca floresan etiketli ve normal hücrelerden ayırt edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, microtumor oluşumu 14, hücre istilası ve metastaz 15, 16, 17, tümör-indüklü anjiyogenezin 15, 1 dinamik davranışları ile ilgili araştırmalar8 ve kanser hücreleri ve ev sahibi arasındaki etkileşimler transgenik zebrabalıkları hatları 5 ürünler özellikle kullanım sırasında, 17 açık bir şekilde canlı balık vücutta görselleştirilebilir faktörleri.
Doktor enjeksiyonlar 16 vasıtasıyla zebra balığı embriyolar: metastaz değerlendirmek için zebra balığı ksenogreft modellerinde yüksek potansiyel esinlenerek, Tg (EGFP çekildiğinde) arasında tailfin alanında farklı meme kanseri hücre çizgilerinin transvasküler ekstravazasyon özellikleri göstermiştir. Dönüştürücü büyüme faktörü-P (TGF-β) 16 ve kemik morfojenik protein transforme rolü (BMP), pro- / anti göğüs kanseri hücre istilası ve metastazda 19 sinyal yolları da bu modelde incelenmiştir. Ayrıca, biz de perivitelline uzay enjeksiyonları ile ksenograft zebrabalıkları modeller kullanılarak tedavüle çeşitli meme kanseri hücre çizgilerinin intravazasyon yeteneğini değinmeyecek.
<p class = "jove_content"> Bu makale perivitelline boşluk veya Doc içine insan meme kanseri hücrelerinin enjekte dayalı Zebra balığı ksenograft modelleri için ayrıntılı protokoller sunar. yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme kullanarak, kan damarlarına intravasation ve avasküler tailfin alanına kan damarlarından hareket farklı insan göğüs kanseri hücrelerinin, invaziv davranışını temsil eder işlem gösterir.Protocol
Representative Results
Discussion
Perivitelline alanı ve Doküman enjeksiyonları ile zebra balığı embriyolar: Burada, Tg (EGFP fli1), meme kanseri hücrelerinin invaziv davranışı incelemek için iki yöntem tarif. transgenik zebra balığı embriyolara kimyasal boya ya da floresan protein ile etiketlenmiş kanser hücreleri enjekte ederek, invazyon ve metastaz dinamik ve uzamsal özellikleri açık bir şekilde bir floresan mikroskobu altında tek hücre veya kümelenme seviyesinde gerçek zamanlı olarak izlenir. Bir çok duru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TGF-β aile üyeleri üzerinde çalışmalar Kanser Genomik Merkezi Hollanda tarafından desteklenmektedir. Sijia Liu ve Jiang Ren Leiden Üniversitesi'nde çalışmanın 4 yıldır Çin Burs Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz MCF10A hücre hatları için Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanser Enstitüsü, Detroit, MI, ABD) teşekkür ederim.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
- Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).
- Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).
- Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).
- Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).
- He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
