Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

Summary

Nous décrivons ici les modèles de xénogreffes de poisson zèbre en utilisant deux sites d'injection différents, à savoir, l' espace périvitelline et canal de Cuvier, pour étudier le comportement invasif et d'évaluer le potentiel de intravasculaire et extravasation des cellules cancéreuses du sein humain, respectivement.

Abstract

Dans de nombreux cas, les patients atteints de cancer ne meurent pas d'une tumeur primaire, mais plutôt à cause de métastases. Bien que de nombreux modèles de rongeurs sont disponibles pour l' étude des métastases cancéreuses in vivo, d' autres efficaces, fiables, les modèles à faible coût sont nécessaires pour accéder rapidement aux effets potentiels de (Epi) modifications génétiques ou des composés pharmacologiques. En tant que tel, nous illustrons et expliquons la faisabilité des modèles de xénogreffes en utilisant des cellules de cancer du sein humain injecté dans des embryons de poisson zèbre pour soutenir cet objectif. Sous le microscope, ou des protéines fluorescentes marquées chimiquement les cellules cancéreuses du sein humain sont transplantés dans des embryons de poisson zèbre transgénique, Tg (fli: EGFP), à l'espace périvitellin ou conduit de Cuvier (Doc) 48 h après la fécondation. Peu de temps après, le processus spatio-temporelle de l'invasion de cellules cancéreuses, la diffusion, et des métastases dans le corps du poisson vivant est visualisé sous un microscope à fluorescence. Les modèles utilisant différents sites d'injection, soit, parespace ivitelline ou Doc sont complémentaires les unes aux autres, ce qui reflète le stade précoce (étape de intravasation) et stade tardif (étape de extravasation) de la cascade métastatique en plusieurs étapes des événements. De plus, l'angiogenèse péritumorale et intratumorale peut être observée avec l'injection dans l'espace périvitellin. La période expérimentale est plus de 8 jours. Ces deux modèles combinent marquage cellulaire, micro-transplantation, et des techniques d'imagerie par fluorescence, ce qui permet l'évaluation rapide de métastases du cancer en réponse à des manipulations génétiques et pharmacologiques.

Introduction

Overt métastases du cancer dans la clinique comprend une série d'événements complexes et en plusieurs étapes appelées la « cascade métastatique ». La cascade a été largement revue et peut être disséqué en plusieurs étapes successives: l' invasion locale, intravasculaire, diffusion, arrestation, extravasation et la colonisation ^{1, 2.} Une meilleure compréhension de la pathogenèse des métastases du cancer et l'élaboration de stratégies de traitement potentielles in vivo nécessitent des modèles d'accueil robustes de propagation des cellules cancéreuses. Modèles murins sont bien établis et sont largement utilisés pour évaluer les métastases ^3, mais ces approches ont une faible efficacité et les limites éthiques et sont coûteuses comme un modèle avant – garde pour déterminer si une manipulation particulière pourrait affecter le phénotype métastatique. D'autres efficaces, fiables, les modèles à faible coût sont nécessaires pour accéder rapidement aux effets potentiels de (Epi) modifications génétiques ou pharmacologcomposés iques. En raison de leur forte homologie génétique avec l'homme et la transparence de leurs embryons de poisson zèbre (Danio rerio) ont émergé comme un modèle de vertébrés importants et sont de plus en plus appliquée à l'étude des processus de développement, les interactions microbe-hôte, les maladies humaines, le dépistage des drogues, etc. . ^4. Les modèles de métastases cancéreuses établies chez le poisson zèbre peut fournir une réponse aux insuffisances des modèles de rongeurs ^{5, 6.}

Bien que la néoplasie spontanée est à peine vu chez le poisson zèbre sauvage ^7, il existe plusieurs techniques de longue date pour induire le cancer désiré chez le poisson zèbre. Mutations du gène cancérigène ou induite par activation de la voie de signalisation peuvent histologiquement et le modèle moléculaire carcinogenèse, mimant la maladie humaine chez le poisson zèbre ^{7, 8, 9.} par taking avantage de diversité avant et arrière manipulations génétiques des oncogènes ou des suppresseurs de tumeurs, (transgéniques) zebrafish ont également permis des études potentiels de la formation du cancer et de maintenance ^{6, 10.} Les modèles de cancer induits chez le poisson zèbre couvrent un large spectre, y compris digestif, reproductif, le sang, le système nerveux et l' épithélium ^6.

L'utilisation du poisson zèbre dans la recherche sur le cancer a augmenté récemment en raison de la mise en place de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines dans cet organisme. Ce fut d' abord rapporté avec des cellules de mélanome métastatique humaines qui ont été greffées avec succès dans des embryons de poisson zèbre au stade de la blastula en 2005 ^11. Plusieurs laboratoires indépendants ont validé la faisabilité de ce travail de pionnier en introduisant toute une gamme de cellules cancéreuses de mammifères dans des lignes à zebrafish différents sites et stades de développement ^{5 <}/ Sup>. Par exemple, des injections près blastodisque et blastocyste du stade blastula; injections dans le sac vitellin, l'espace périvitellin, canal de Cuvier (Doc), et la veine cardinale postérieure de 6-h- à des embryons âgés de 5 jours; et des injections dans la cavité péritonéale de vieux de 30 jours de larves immunodéprimés ont été effectuées ^{5, 12.} De plus, la tumeur allogénique transplantations ont également été signalées dans ^{12 zebrafish, 13.} L'un des grands avantages de l'utilisation xénogreffes est que les cellules cancéreuses greffées peuvent être facilement marquées par fluorescence et distingué des cellules normales. Par conséquent, les enquêtes sur les comportements dynamiques de la formation de microtumor ^14, l' invasion cellulaire et la métastase ^{15, 16, 17,} l' angiogenèse induite par une tumeur ^{15, 1}8, et les interactions entre les cellules cancéreuses et les facteurs de l' hôte ¹⁷ peut être clairement visualisé dans le corps de poissons vivants, en particulier lorsque les lignes de poisson – zèbre transgénique sont appliqués ^5.

Inspiré par le fort potentiel des modèles de poisson zèbre de xénogreffes pour évaluer les métastases, nous avons démontré les propriétés transvasculaires extravasation de différentes lignées cellulaires du cancer du sein dans la zone tailfin de Tg (FLI: EGFP) embryons de poisson zèbre par des injections de Doc ^16. Le rôle de facteur de transformation-β (TGF-β de) ¹⁶ et protéines morphogénétiques osseuses (BMP) ¹⁹ voies de signalisation dans pro / invasion des cellules cancéreuses anti-sein et métastases croissance ont également été étudiée dans ce modèle. De plus, nous avons également récapitulé la capacité de pénétration intravasculaire de diverses lignées cellulaires du cancer du sein en circulation en utilisant des modèles de xénogreffes avec des injections de poisson zèbre espace périvitelline.

<p class = "«" jove_content »> Cet article présente des protocoles détaillés pour les modèles à base de poisson zèbre xénogreffes lors de l'injection des cellules cancéreuses du sein humain dans l'espace périvitelline ou Doc. En utilisant l'imagerie de fluorescence à haute résolution, nous montrons le processus représentatif de intravasculaire dans les vaisseaux sanguins et le comportement invasif des différentes cellules de cancer du sein humain, qui se déplacent à partir des vaisseaux sanguins dans la zone avasculaire tailfin.

Protocol

Toutes les recherches en utilisant la Tg zebrafish fluorescente transgénique (de Fli: EGFP) souche, qui a amélioré la protéine fluorescente verte (EGFP) marqué à la vasculature 20, y compris le logement et les expériences, a été réalisée conformément aux directives internationales et a été approuvé par le Comité institutionnel local pour le bien-être des animaux (Dier Ethische Commissie (DEC) du Centre médical de l'Université de Leiden. Remarque: Comme résumé sur la f…

Representative Results

Dans le modèle de poisson zèbre xénogreffe embryonnaire avec une injection d'espace périvitelline, la diffusion hématogène des cellules cancéreuses marquées dans le corps du poisson est considéré comme la migration active. Ce processus peut être détecté et quantifié sous un microscope à fluorescence, comme décrit dans les procédés ci-dessus. Pour illustrer ce modèle de xénogreffe, nous avons suivi le processus de diffusion des différentes lignées cellulaires de …

Discussion

Ici, nous avons décrit deux méthodes pour étudier le comportement invasif des cellules cancéreuses du sein dans Tg (FLI1: EGFP) embryons de poisson zèbre, avec des injections d'espace périvitelline et Doc. En injectant des cellules cancéreuses marquées par un colorant chimique ou protéine fluorescente dans des embryons de poisson zèbre transgénique, les caractéristiques dynamiques et spatiales de l'invasion et les métastases peuvent être clairement suivis en temps réel à la seule cellule…

Materials

Agarose	MP Biomedicals	AGAF0500
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus	300038
Cholera enterotoxin	Calbiochem	227035
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	21041025
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc	11252-20
Epidermal growth factor	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	16140071
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
HEK293T cell line	American Type Culture Collection	CRL-1573
Hydrocortisone	SigmaAldrich	227035
Horse serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Insulin	SigmaAldrich	I-6634
MCF10A (M1) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MCF10Aras (M2) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MDA-MB-231 cell line	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)	Eppendorf	F276456I
pCMV-VSVG plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PLV-mCherry plasmid	Addgene	36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Polybrene	SigmaAldrich	107689
Prism 4 software	GraphPad Software
pRSV-REV plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base	SigmaAldrich	11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher Scientific	15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm)	SigmaAldrich	P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040