Voorspellen van genstyling door middel van de spatiotemporale controle van siRNA-vrijgave van foto-responsieve polymere nanocarriers
Summary
We presenteren een nieuwe methode die foto-responsieve blokcopolymeren gebruikt voor efficiëntere spatiotemporale controle van gen-stilzetting zonder detecteerbare off-target effecten. Bovendien kunnen veranderingen in genuitdrukking voorspeld worden door middel van straightforward siRNA release analyses en eenvoudige kinetische modellering.
Abstract
Nieuwe materialen en methoden zijn nodig om de binding beter te beheersen tegen nucleïnezuren vrij voor een breed scala aan toepassingen die de nauwkeurige regulering van de genactiviteit vereisen. In het bijzonder zouden nieuwe stimuli-responsieve materialen met verbeterde spatiotemporale controle over genexpressie transplanteerbare platforms in drug ontdekking en regeneratieve geneeskunde technologieën ontgrendelen. Bovendien zou een verbeterd vermogen om het nucleïnezuur uit materialen controle van de ontwikkeling van gestroomlijnde behandelingswijzen Nanodrager werkzaamheid voorspellen a priori leidt tot versnelde screening van bestelwagens. Hierin presenteren we een protocol voor het voorspellen van genstartingsefficiënties en het bereiken van spatiotemporale controle over genuitdrukking door middel van een modulair fotoresponsief nanocarrier systeem. Kleine interfererende RNA (siRNA) wordt gecomplexeerd met mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylaat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymeren omRm stabiele nanocarriers die met licht kunnen worden gecontroleerd om afstembare, on / off siRNA release te vergemakkelijken. We beschrijven twee complementaire analyses die fluorescentiecorrelatie spectroscopie en gelelektroforese gebruiken voor de nauwkeurige kwantificering van siRNA-vrijlating uit oplossingen die intracellulaire omgevingen nabootsen. Informatie verkregen uit deze analyses werd geïncorporeerd in een simpel RNA interferentie (RNAi) kinetisch model om de dynamische silencing responsen te voorspellen op verschillende foto-stimulusomstandigheden. Op zijn beurt hebben deze geoptimaliseerde bestralingsomstandigheden het mogelijk gemaakt om een nieuw protocol te vergemakkelijken voor het spatiotemporaal regelen van gensturing. Deze methode kan cellulaire patronen genereren in gen expressie met cel-naar-cel resolutie en geen detecteerbare off-target effecten. Samenvattend biedt onze aanpak een makkelijk te gebruiken methode voor het voorspellen van dynamische veranderingen in genuitdrukking en nauwkeurige controle van siRNA-activiteit in ruimte en tijd. Deze reeks assays kunnen gemakkelijk aangepast worden om een grote verscheidenheid van ot te testenHaar stimuli-responsieve systemen om belangrijke uitdagingen aan te pakken die betrekking hebben op een groot aantal toepassingen in biomedisch onderzoek en medicijnen.
Introduction
Kleine interfererende RNA's (siRNAs) bemiddelen na transcriptie gen door middel van een katalytische RNAi-weg die zeer specifiek, krachtig en afwisselend is voor vrijwel elk doelgen 1 . Deze veelbelovende eigenschappen hebben de werking van siRNA-therapeutica in menselijke klinische proeven mogelijk gemaakt voor de behandeling van talrijke aandoeningen, waaronder metastatisch melanoom en hemofilie 2 , 3 . Er bestaan echter belangrijke leveringsproblemen die de vertaling hebben belemmerd 4 . In het bijzonder moeten leveringsvoertuigen stabiel blijven en siRNAs beschermen tegen extracellulaire afbraak, maar ook de lading in de cytoplasma 5 vrijlaten. Bovendien vereisen veel RNAi-toepassingen verbeterde methoden voor het regelen van gensweergave in ruimte en tijd 6 , die bijwerkingen in siRNA-therapeutica 7 zullen verminderen en transformatieve aDvances in toepassingen variërend van celmicroarrays voor geneesmiddelontdekking 8 tot modulatie van celreacties in regeneratieve steigers 9 . Deze uitdagingen wijzen op de behoefte aan nieuwe materialen en methoden om de binding tegen vs. vrijgave in siRNA nanocarriers beter te beheersen.
Een van de meest veelbelovende strategieën voor het regelen van siRNA-vrijlating en het verbeteren van spatiotemporale regulering is het gebruik van stimuli-responsieve materialen 10 . Bijvoorbeeld, een grote verscheidenheid aan biomaterialen zijn ontworpen met veranderbare nucleïnezuurbindingsaffiniteit in reactie op veranderd redoxpotentiaal of pH, of toegepaste magnetische velden, echografie of licht 11 . Hoewel veel van deze systemen verbeterde controle tonen op nucleïnezuuractiviteit, is het gebruik van licht als een trigger bijzonder gunstig door zijn onmiddellijke temporele respons, nauwkeurige ruimtelijke resolutie en gemak van afstelbaarheid <suP class = "xref"> 12. Bovendien is het potentieel van fotogevoelige technologieën voor het regelen van genuitdrukking aangetoond door state-of-the-art induceerbare promotor- en optogenetische regulatorsystemen; Deze systemen lijden echter aan tal van uitdagingen, waaronder beperkte capaciteiten om endogene genen te reguleren, veiligheidskwesties zoals immunogeniciteit en moeilijkheden bij het leveren van multi-component assemblies 13 , 14 , 15 . Foto-responsieve siRNA nanocarriers zijn ideaal om deze nadelen te overwinnen en bieden een eenvoudiger en robuuste aanpak om de genuitdrukking 16 , 17 , 18 op een spatiotemporale wijze te moduleren. Helaas blijven methoden om het resulterende eiwit-knockdown-reactie nauwkeurig voor te stellen, onduidelijk.
Een belangrijke uitdaging is dat kwantitatieve evaluaties van siRNA release zijnZeldzaam 19 , 20 , en zelfs wanneer deze evaluaties worden uitgevoerd, zijn ze niet gekoppeld aan analyses van de dynamiek van siRNA / eiwitomvang. Zowel de hoeveelheid siRNA vrijgegeven als zijn persistentie / levensduur zijn belangrijke determinanten van de resulterende gendempingsdynamiek; Derhalve is een gebrek aan dergelijke informatie een belangrijke ontkoppeling die precieze nauwkeurige voorspelling van dosisrespons in RNAi 21 voorkomt. Aanpakken van deze uitdaging zou de formulering van de passende structuur-functie relaties in nanocarriers en beter biomaterialen ontwerpen 22 versnellen. Bovendien zouden dergelijke benaderingen de ontwikkeling van effectievere siRNA-doseringsprotocollen mogelijk maken. In een poging om de dynamische stilzettingsrespons te begrijpen, hebben verschillende groepen wiskundige modellen van RNAi 23 , 24 , 25 onderzocht. Deze kaders warenSuccesvol in het verstrekken van inzichten in siRNA-gemedieerde veranderingen in genuitdrukking en het identificeren van snelheidsbeperkende stappen 26 . Deze modellen zijn echter alleen toegepast op commerciële genleveringssystemen ( bijvoorbeeld lipofectamine en polyethylenimine (PEI)) die niet in staat zijn de gecontroleerde siRNA-vrijlating te verzekeren, en de complexiteit van de modellen heeft hun nut 27 ernstig beperkt. Deze tekortkomingen wijzen op een onvervulde behoefte aan nieuwe materialen die in staat zijn om nauwkeurig afstelbare siRNA-vrijlating gecombineerd met gestroomlijnd en makkelijk te gebruiken voorspellende kinetische modellen.
Onze methode behandelt al deze uitdagingen door de integratie van een lichtgevoelig nanocarrier platform met gekoppelde methoden om de gratis siRNA- en model RNAi-dynamiek te kwantificeren. In het bijzonder wordt de nauwkeurig gecontroleerde siRNA-versie 28 van ons platform gecontroleerd door twee complementaire methoden voor het nauwkeurig kwantificeren van ingekapseld vs. unGebonden siRNA. De experimentele gegevens uit deze analyses worden ingevoerd in een simpel kinetisch model om de efficiëntie van de genen te voorspellen a priori 29 . Tenslotte wordt de on / off-aard van de nanocarrieren gemakkelijk uitgebuit om celpatronen te genereren in de gen expressie met ruimtelijke controle op de cellulaire lengte schaal. Zo biedt deze methode een gemakkelijk aan te passen methode voor het beheersen en voorspellen van gensweergave in een verscheidenheid aan toepassingen die zouden profiteren van spatiotemporale regulering van celgedrag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een paar stappen in de methode die bijzonder kritisch zijn. Bij de formulering van de nanocarrieren zijn de volgorde van componenttoevoeging en mengsnelheid twee belangrijke parameters die effectiviteit beïnvloeden 39 . Dit protocol vereist dat de kationische component, mPEG- b -P (APNBMA), op druppelsgewijze wijze wordt toegevoegd aan het anionische bestanddeel, siRNA tijdens het vortexeren. Afhankelijk van het totale formuleringsvolume duurt dit mengproces 3-6 s. Om te testen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (NIH) voor financiële steun via een Institutions Development Award (IDeA) onder subsidienummer P20GM103541 en subsidie nummer P20GM10344615. De uitspraken hierin weerspiegelen niet de standpunten van de NIH. We erkennen ook het Delaware Biotechnology Institute (DBI) en het Delaware Economic Development Office (DEDO) voor financiële ondersteuning via het Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) award (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
