光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測
Summary
本発明者らは、検出可能なオフターゲット効果なしに遺伝子サイレンシングのより効率的な時空間制御のために光反応性ブロックコポリマーを使用する新規な方法を提示する。さらに、遺伝子発現の変化は、単純なsiRNA放出アッセイおよび単純な運動モデルを用いて予測することができる。
Abstract
遺伝子活性の正確な制御を必要とする広範囲の用途のための核酸の結合対放出をより良好に制御するために、新しい材料および方法が必要とされている。特に、遺伝子発現より時空間制御が改良された新規の刺激応答材料は、創薬および再生医療技術において翻訳可能なプラットフォームのロックを解除するであろう。さらに、材料からの核酸放出を制御する能力の向上は、ナノキャリア効果を先験的に予測する合理的な方法の開発を可能にし、送達媒体の迅速なスクリーニングをもたらす。本明細書では、遺伝子サイレンシング効率を予測し、モジュラー光応答性ナノキャリアシステムを介して遺伝子発現に対する時空間制御を達成するためのプロトコールを提示する。低分子干渉RNA（siRNA）は、mPEG- b-ポリ（5-（3-（アミノ）プロポキシ）-2-ニトロベンジルメタクリレート）（mPEG- b -P（APNBMA））ポリマーとfo安定したナノキャリヤを光で制御して、調整可能なオン/オフsiRNA放出を容易にすることができる。細胞内環境を模倣する溶液からのsiRNA放出の正確な定量化のために、蛍光相関分光法およびゲル電気泳動を用いる2つの相補的アッセイを概説する。これらのアッセイから得られた情報は、様々な光刺激条件に対する動的サイレンシング応答を予測するための単純RNA干渉（RNAi）動態モデルに組み込まれた。次に、これらの最適化照射条件は、遺伝子サイレンシングを空間的に制御するための新しいプロトコールの改良を可能にした。この方法は、細胞間分解能および検出可能なオフターゲット効果を伴わない遺伝子発現における細胞パターンを生成することができる。我々のアプローチは、遺伝子発現の動的変化を予測し、時空間でsiRNAの活性を正確に制御する使いやすい方法を提供します。この一連のアッセイは、様々なotを試験するために容易に適合させることができる生物医学研究および医学における多数のアプリケーションに関連する重要な課題に取り組むために、彼女の刺激応答システムを開発しました。
Introduction
低分子干渉RNA（siRNA）は、事実上すべての標的遺伝子1に対して高度に特異的で強力で触媒的なRNAi経路を介して転写後遺伝子サイレンシングを仲介します1 。これらの有望な特性は、転移性黒色腫および血友病2、3を含む多数の疾患の治療のためのヒト臨床試験に進めるためにsiRNA治療剤を有効にしています。しかし、翻訳を妨げている重要な配送問題は依然として残っている4 。特に、送達媒体は安定したままでなければならず、siRNAを細胞外分解から保護しなければならず、ペイロードも細胞質に放出される5 。さらに、多くのRNAiアプリケーションでは、siRNA治療法7における副作用を軽減し、形質転換を可能にする空間および時間6における遺伝子サイレンシングを制御する改良された方法が必要とされている創薬8のための細胞マイクロアレイから再生骨格の細胞応答の調節に至るまでの用途における驚異9 。これらの課題は、siRNAナノキャリアにおける結合対放出をより良好に制御するための新しい材料および方法の必要性を強調している。
siRNAの放出を制御し、時空間調節を強化するための最も有望な戦略の1つは、刺激応答性物質の使用である10 。例えば、変化した酸化還元電位またはpH、または印加された磁場、超音波、または光11に応答して変化する核酸結合親和性を有する多種多様な生体材料が設計されている。これらの系の多くは、核酸活性に対する改善された制御を示すが、トリガーとしての光の使用は、その瞬間的な時間応答、正確な空間分解能、および調整性の容易さのために特に有利である<sup class = "xref"> 12。さらに、遺伝子発現を調節するための光感受性技術の可能性は、最先端の誘導性プロモーターおよび光生成制御システムによって実証されている。しかしながら、これらのシステムは、限られた内因性遺伝子を調節する能力は、そのような免疫原性などの安全性の問題、および多成分アセンブリ13、14、15を送達する際の困難を含む多くの課題に悩まされています。光応答性のsiRNAナノキャリアは、理想的には、これらの欠点を克服し、時空間的遺伝子発現16、17、18を調節するより簡単でより堅牢なアプローチを提供するために適しています。残念なことに、得られたタンパク質ノックダウン応答を正確に予測する方法は依然として分かりません。
重要な課題は、siRNA放出の定量的評価が、レア19、20、およびこれらの評価を行った場合であっても、彼らが、siRNA /タンパク質代謝回転のダイナミクスの解析に結合されていません。放出されるsiRNAの量およびその持続性/寿命は、得られる遺伝子サイレンシングダイナミクスの重要な決定因子である。そのような情報の欠如は、RNAi 21の用量応答の正確な予測を妨げる主要な切断である。この挑戦に取り組むことは、ナノキャリヤにおける適切な構造 – 機能関係の形成を促進し、生体材料設計22をより良く伝えるだろう。さらに、そのようなアプローチは、より効果的なsiRNA投薬プロトコールの開発を可能にする。ダイナミックなサイレンシング応答を理解しようとする試みには、いくつかのグループは、RNAi 23、24、25の数学的モデルを検討しました。これらのフレームワークは遺伝子発現におけるsiRNA媒介性変化の洞察を提供し、律速段階26を同定することに成功した。しかしながら、これらのモデルは、制御されたsiRNA放出ができない市販の遺伝子送達システム（ 例えば 、リポフェクタミンおよびポリエチレンイミン（PEI））にのみ適用されており、モデルの複雑さは、その有用性を著しく制限している27 。これらの欠点は、合理化された使い易い予測動態モデルと組み合わせて、正確に同調可能なsiRNA放出を可能にする新しい物質に対する満たされていないニーズを強調している。
我々の方法は、光感受性ナノキャリアープラットフォームと、結合siRNAとモデルRNAiのダイナミクスを定量する結合法を統合することにより、これらの課題を解決します。特に、我々のプラットフォームの正確に制御されたsiRNA放出28は、カプセル化されたものと un結合したsiRNA。これらのアッセイからの実験データは、先験的に遺伝子サイレンシング効率を予測するための単純な動態モデルに入力される29 。最後に、ナノキャリアのオン/オフ特性は、細胞の長さスケールの空間的制御を伴う遺伝子発現における細胞パターンの生成に容易に利用される。このように、この方法は、細胞挙動の時空間的調節から利益を得る多様な適用において遺伝子サイレンシングを制御および予測するための容易に適合可能な方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法には、特に重要ないくつかのステップがあります。ナノキャリアを製剤化する場合、成分の添加の順序および混合速度は、有効性に影響する2つの重要なパラメータである39 。このプロトコールでは、カチオン性成分、mPEG- b -P（APNBMA）をアニオン性成分であるsiRNAに、ボルテックスしながら滴下方式で添加する必要がある。総処方量に依存して、この混合プロ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、助成金番号P20GM103541および助成金番号P20GM10344615の下、制度開発賞（IDeA）を通じて財政的支援のために国立衛生研究所（NIH）の国立総合医学研究所に感謝します。ここの記述は、NIHの見解を反映していない。また、デラウエアバイオテクノロジー研究所（DBI）とデラウェア経済開発オフィス（DEDO）は、バイオテクノロジーセンター（Bioscience CAT）賞（12A00448）を通じて財政的支援を受けていることも認めています。
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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