Predicción de la silenciación génica a través del control espaciotemporal de la liberación de siRNA de Nanocarriers poliméricos fotosensibles
Summary
Presentamos un nuevo método que utiliza copolímeros de bloques fotosensibles para un control espaciotemporal más eficiente del silenciamiento génico sin efectos detectables fuera del objetivo. Además, los cambios en la expresión génica se puede predecir utilizando sencillo siRNA liberación ensayos y modelado cinético simple.
Abstract
Se necesitan nuevos materiales y métodos para controlar mejor la unión frente a la liberación de ácidos nucleicos para una amplia gama de aplicaciones que requieren la regulación precisa de la actividad génica. En particular, nuevos materiales sensibles a los estímulos con un control espaciotemporal mejorado sobre la expresión génica desbloquearían plataformas traducibles en tecnologías de descubrimiento de fármacos y medicina regenerativa. Además, una mayor capacidad para controlar la liberación de ácido nucleico a partir de materiales permitiría el desarrollo de métodos aerodinámicos para predecir la eficacia del nanocarrier a priori , dando lugar a un rastreo acelerado de los vehículos de administración. Aquí, presentamos un protocolo para predecir el gen silenciamiento eficiencias y lograr spatiotemporal control sobre la expresión de genes a través de un modular fotorresistente sistema nanocarrier. El pequeño ARN interferente (ARNsi) se compleja con los polımeros de mPEG- b -poli (metacrilato de 5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobencilo) (mPEG- b- P (APNBMA)) foRm nanocarriers estables que pueden ser controlados con luz para facilitar tunable, on / off siRNA liberación. Describimos dos ensayos complementarios que emplean espectroscopia de correlación de fluorescencia y electroforesis en gel para la cuantificación precisa de la liberación de siRNA a partir de soluciones que imitan los ambientes intracelulares. La información obtenida de estos ensayos se incorporó en un simple modelo cinético de interferencia de ARN (RNAi) para predecir las respuestas de silenciamiento dinámico a diversas condiciones de foto-estímulo. A su vez, estas condiciones de irradiación optimizadas permitieron perfeccionar un nuevo protocolo para controlar espacialmente el silenciamiento de genes. Este método puede generar patrones celulares en la expresión génica con la resolución célula a célula y sin efectos detectables fuera de la meta. En conjunto, nuestro enfoque ofrece un método fácil de usar para predecir los cambios dinámicos en la expresión génica y controlar con precisión la actividad del siRNA en el espacio y el tiempo. Este conjunto de ensayos puede adaptarse fácilmente para probar una amplia variedad de otSus sistemas de respuesta a los estímulos para abordar desafíos clave pertinentes a una multitud de aplicaciones en la investigación biomédica y la medicina.
Introduction
Los pequeños ARNs de interferencia (siRNAs) median el silenciamiento génico post-transcripcional a través de una vía catalítica de ARNi que es altamente específica, potente y adaptable a prácticamente cualquier gen diana 1 . Estas características prometedoras han permitido que la terapéutica del siRNA avance en ensayos clínicos humanos para el tratamiento de numerosas enfermedades, incluyendo el melanoma metastásico y la hemofilia 2 , 3 . Sin embargo, persisten problemas de entrega importantes que han impedido la traducción 4 . En particular, los vehículos de entrega deben permanecer estables y proteger siRNAs de la degradación extracelular, sin embargo, también liberar la carga útil en el citoplasma [ 5] . Además, muchas aplicaciones de RNAi requieren métodos mejorados para regular el silenciamiento de genes en el espacio y el tiempo [ 6] , lo que reducirá los efectos secundarios en siARN terapéutica [ 7] y permitir transformador aDvances en aplicaciones que van desde microarrays de células para el descubrimiento de fármacos 8 a la modulación de las respuestas celulares en andamios regenerativos [ 9] . Estos desafíos destacan la necesidad de nuevos materiales y métodos para controlar mejor la unión vs liberación en los nanocarriers siRNA.
Una de las estrategias más prometedoras para controlar la liberación de siRNA y mejorar la regulación espaciotemporal es el uso de materiales sensibles a los estímulos 10 . Por ejemplo, se ha diseñado una amplia variedad de biomateriales con afinidad de unión a ácidos nucleicos variable en respuesta al potencial o potencial redox alterado, oa campos magnéticos aplicados, ultrasonidos o luz 11 . Aunque muchos de estos sistemas demuestran un control mejorado sobre la actividad del ácido nucleico, el uso de la luz como gatillo es particularmente ventajoso debido a su respuesta temporal instantánea, resolución espacial precisa y facilidad de afinación <suP class = "xref"> 12. Además, el potencial de las fotoprotectoras para la regulación de la expresión génica ha sido demostrado por el estado de la técnica promotor inducible y sistemas reguladores optogenéticos; Sin embargo, estos sistemas sufren de numerosos retos incluyendo capacidades limitadas para regular genes endógenos, preocupaciones de seguridad tales como inmunogenicidad, y dificultades en la entrega de ensamblajes de múltiples componentes 13 , 14 , 15 . Foto-sensores siRNA nanocarriers son ideales para superar estos inconvenientes y proporcionar un enfoque más simple y más robusto spatiotemporalmente modular la expresión génica [ 16 , 17 , 18] . Desafortunadamente, los métodos para predecir con exactitud la respuesta resultante de desmontaje de la proteína siguen siendo esquivos.
Un desafío clave es que las evaluaciones cuantitativas de la liberación de siRNA sonRara 19 , 20 , e incluso cuando se realizan estas evaluaciones, no se han acoplado a los análisis de siRNA / proteína dinámica de rotación. Tanto la cantidad de siRNA liberado y su persistencia / vida son determinantes importantes de la dinámica de silenciamiento de genes resultante; Por lo tanto, la falta de dicha información es una importante desconexión que impide una predicción precisa de la dosis-respuesta en RNAi [ 21] . Abordar este reto aceleraría la formulación de las relaciones estructura-función apropiadas en nanocarriers y mejoraría el conocimiento de los diseños de biomateriales 22 . Además, tales enfoques permitirían el desarrollo de protocolos de dosificación de siRNA más eficaces. En un intento de entender la respuesta silenciosa dinámica, varios grupos han investigado modelos matemáticos de RNAi 23 , 24 , 25 . Estos marcos fueronÉxito en la prestación de información sobre siRNA mediada por los cambios en la expresión génica y la identificación de la tasa de limitación de los pasos [ 26] . Sin embargo, estos modelos se han aplicado sólo a los sistemas comerciales de entrega de genes ( por ejemplo , Lipofectamine y polietilenimina (PEI)) que no son capaces de liberación controlada siRNA, y la complejidad de los modelos ha limitado severamente su utilidad [ 27] . Estas deficiencias resaltan una necesidad insatisfecha de nuevos materiales capaces de sincronizar con precisión la liberación de siRNA combinada con modelos dinámicos predictivos simplificados y fáciles de usar.
Nuestro método aborda todos estos retos a través de la integración de una plataforma fotovoltaica sensible a la luz con métodos acoplados para cuantificar la ARNi libre y la dinámica de RNAi modelo. En particular, la plataforma 28 controlada con precisión siRNA liberación 28 se supervisa por dos métodos complementarios para cuantificar con precisión encapsulado vs unLigado siRNA. Los datos experimentales de estos ensayos se introducen en un modelo cinético simple para predecir el gen silenciamiento eficiencias a priori [ 29] . Por último, la naturaleza on / off de los nanocarriers se explota fácilmente para generar patrones celulares en la expresión génica con control espacial en la escala de longitud celular. Por lo tanto, este método proporciona un método fácilmente adaptable para controlar y predecir el silenciamiento de genes en una variedad de aplicaciones que se beneficiarían de la regulación spatiotemporal del comportamiento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay algunos pasos en el método que son particularmente críticos. Al formular los nanocarriers, el orden de la adición de componentes y velocidad de mezcla son dos parámetros importantes que influyen en la eficacia [ 39] . Este protocolo requiere que el componente catiónico, mPEG- b- P (APNBMA), se añada al componente aniónico, siRNA, de una forma gota a gota mientras se agita en vórtice. Dependiendo del volumen total de la formulación, este proceso de mezcla toma 3-6 s. Para pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) por el apoyo financiero a través de un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) bajo el número de concesión P20GM103541, así como el número de la concesión P20GM10344615. Las declaraciones aquí contenidas no reflejan las opiniones de los NIH. También reconocemos al Instituto de Biotecnología de Delaware (DBI) y la Oficina de Desarrollo Económico de Delaware (DEDO) por su apoyo financiero a través del premio Bioscience CAT para el Bioscience (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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