胚荧光恢复后的染色质松动的光漂分析, 允许足月发展
Summary
染色质松动似乎参与了卵裂球的发展潜力。然而, 目前尚不清楚染色质松动是否可以作为胚胎发育潜能的可靠指标。在这里, 我们描述了一个实验系统, 其中染色质松动评价受精卵可以发展到足月。
Abstract
实时成像是一个强大的工具, 允许分析分子事件在个体发育期间。最近, 染色质松动或开放性已被证明参与了细胞分化潜能的多潜能胚胎干细胞。此前据报道, 与胚胎干细胞相比, 受精卵港的染色质结构非常松动, 暗示其与全能的关系。然而, 直到目前为止, 还没有讨论这一极其松动/开放的染色质结构对胚胎发育潜力是否重要。在本研究中, 为了检验这一假说, 本文研制了一种实验系统, 在受精卵的光漂白后, 通过荧光恢复分析, 得到了不明显的损伤。重要的是, 除了共焦激光扫描显微镜, 这个实验系统还需要一个热水瓶加热器。这项研究的结果表明, 光漂白分析 (酶) 分析后的荧光恢复可以用来调查胚染色质中的分子事件是否对足月的发展是重要的。
Introduction
受精后, 染色质结构动态改变, 胚染色质结构最终建立1,2。在此期间, 在父系 pronuclei, 显性染色质蛋白从精蛋白转化为组蛋白。由此产生的染色质与精子和雌性卵母细胞在几个点上的差别非常大 (例如, 组蛋白变异组成, 组蛋白修饰)。因此, 形成的胚染色质被认为是重要的后续胚胎发育。然而, 尽管努力揭示胚染色质结构的细节, 在长时间内, 评价受精卵质量的方法或预测其在单细胞阶段的全面发展, 通过分析其染色质结构从来没有建立。
在先前的研究中, 发现受精卵有一个非常松散的染色质结构3。目前, 染色质松动或开放性被认为是一个重要因素的细胞分化潜能的胚胎干细胞 (ES) 细胞4。ES 细胞在自然界中并不表现出同质性, 而是相当异构;在 ES 细胞菌落中, 一些瞬时获得的分化电位较高, 可与卵裂球的两细胞阶段胚胎相媲美。在这种向双细胞状状态的过渡过程中, ES 细胞的染色质松动改变为与两细胞阶段胚胎5相媲美的东西。因此, 染色质松动似乎是重要的细胞分化潜力, 这是可能的广泛开放染色质在受精卵是有益的评价胚发展潜力。
实时成像是一个强大的工具, 允许分析在个体发育期间的分子事件, 因为这种方法允许随后的发展, 甚至是6的足月发展。作为一种实时成像方法, 酶分析已用于检查前体细胞和 ES 细胞3,4,5的染色质松动。如果通过酶分析对胚染色质松动进行分析, 对足月发育无不良影响, 可能是评价单细胞期胚胎质量的重要工具。然而, 这一实验方法对足月发展的影响还未被研究。最近, 建立了一个利用酶评价胚染色质松动的实验系统。因为这是一个新的观察系统的受精卵, 它被称为胚酶 (zFRAP)。zFRAP 没有严重影响全面发展, 并已在别处报告7。在本报告中, 介绍了该实验方法的协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
如本研究所揭示的, zFRAP 分析不会对足月发展造成严重损害, 这表明该方法是揭示分子事件与胚胎发育潜能之间关联的非常有用的工具。在重新编程过程中, 进入 ES 细胞的双细胞状状态, 这些细胞的差异电位与两细胞阶段胚胎的高度一样高, 染色质松动改变为与两细胞级胚胎5的可比性。因此, 有可能胚染色质松动对胚胎发育潜力很重要。体细胞细胞核转移到卵母细胞的细胞质显示, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢木聪岸上、沙耶香和歌山、博明 Nagatomo、木聪 Kamimura 和假名田文雄, 提供了重要的评论和技术支持。这项工作由教育、文化、体育、科学和技术部部分资助, 以促进国家大学对作案手法的改革;日本促进科学学会 (16H02593)、田真央科学基金会和武田科学基金会 T.W。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
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