Summary

Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.

Abstract

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.

Introduction

Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para revelar los detalles de la estructura de la cromatina cigóticos durante largos períodos, nunca han sido los métodos para evaluar la calidad de cigotos o predecir su desarrollo de término de la etapa de una célula mediante el análisis de su estructura de la cromatina establecido.

En el estudio anterior, se descubre que los cigotos tienen una estructura de cromatina muy flojos3. Actualmente, se cree que un factor importante para la diferenciación celular potencial de células madre embrionarias (ES)4flojedad de cromatina o apertura. Células madre embrionarias no presentan homogeneidad en la naturaleza, pero son bastante heterogéneos; en las colonias de células ES, algunas transitoriamente adquieren un mayor potencial de diferenciación comparable a blastómeros de embriones en estadío de dos células. Durante esta transición en la célula dos como estado, flojedad de la cromatina en ES células cambios en lo que es comparable con la etapa de dos células de embriones5. Así, flojedad de cromatina parece ser importante para el potencial de diferenciación celular y es posible que abra ampliamente la cromatina en cigotos es útil para la evaluación del potencial de desarrollo cigóticos.

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite para el análisis de eventos moleculares durante la ontogénesis, ya que este método permite el posterior desarrollo y desarrollo incluso termino6. Como uno de los métodos de proyección de imagen vivo, análisis FRAP se ha utilizado para examinar la holgura de la cromatina en embriones preimplantación y ES células3,4,5. Si flojedad de cromatina cigóticos puede analizarse sin un efecto perjudicial sobre el desarrollo del término por el FRAP análisis, puede ser una valiosa herramienta para la evaluación de la calidad de los embriones en la etapa de una célula. Sin embargo, no se han examinado los efectos sobre el desarrollo del término por este método experimental. Recientemente, se desarrolló un sistema experimental con FRAP para evaluar la flojedad de cromatina cigóticos. Porque esto era un nuevo sistema de observación de cigotos, se dice que como FRAP cigóticos (zFRAP). zFRAP no afectó críticamente el término desarrollo y ha sido divulgado a otra parte7. En este informe se describe el protocolo de este método experimental.

Protocol

Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Yamanashi. El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de los experimentos del Animal de la Universidad de Yamanashi (número de permiso: A24-50). Todas las cirugías fueron realizadas bajo anestesia tribromoethanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Un resumen ilustrado de los procedimientos y horarios se muestran en la <strong cl…

Representative Results

Análisis de zFRAP con eGFP-H2B Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando l…

Discussion

Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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