Zygotic fluorescentie herstel na het ontkleuren aangebracht van foto analyse voor chromatine losheid waarmee voldragen ontwikkeling

Summary

Chromatine losheid lijkt te worden betrokken in het ontwikkelings potentieel van blastomeren. Het is echter niet bekend of chromatine losheid kan worden gebruikt als een betrouwbare index voor de ontwikkelings potentieel voor embryo’s. Hier, is een experimenteel systeem waarin chromatine losheid-geëvalueerd zygoten tot volledige termijn ontwikkelen kunnen beschreven.

Abstract

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben. Onlangs, chromatine losheid of openheid is aangetoond te worden betrokken in het potentieel van de celdifferentiatie van pluripotente embryonale stamcellen. Eerder werd gemeld dat in vergelijking met embryonale stamcellen, zygoten haven een uiterst losgedraaide chromatine-structuur, die haar relatie met hun totipotent duiden. Echter, tot nu toe, het niet is beantwoord of de structuur van deze uiterst losgemaakt/open chromatine belangrijk voor de embryonale ontwikkelings potentieel is. In de huidige studie, om te onderzoeken van deze hypothese, werd een experimenteel systeem welke zygoten die werden geanalyseerd door fluorescentie herstel na foto-bleken zich tot termijn zonder significante schade ontwikkelen kan ontwikkeld. Nog belangrijker is, moet dit experimenteel systeem alleen een kachel van thermos-plaat naast een confocale laser scanning microscoop. De bevindingen van deze studie suggereren dat herstel van de fluorescentie na foto-bleken analyse (FRAP) analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken of de moleculaire gebeurtenissen in zygotic chromatine belangrijk voor de ontwikkeling van de voldragen zijn.

Introduction

Na de bevruchting, de structuur van de chromatine is dynamisch gewijzigd en zygotic chromatine structuur is dan uiteindelijk gevestigde^1,2. Tijdens deze periode, in de vaderlijke pronuclei, is de dominante chromatine proteïne veranderde van tijdje in Histon. De resulterende chromatine is zeer verschillend van die van sperma en eicellen van de vrouw in verschillende punten (bijvoorbeeld, histone variant samenstelling, histone wijziging). Aldus wordt gevormde zygotic chromatine gezien als belangrijk voor de latere ontwikkeling van het embryo. Echter, ondanks pogingen om de details van de structuur van de chromatine zygotic onthullen over lange periodes, methoden voor de beoordeling van de kwaliteit van zygoten of te voorspellen hun voldragen ontwikkeling in het stadium van een cel door het analyseren van de structuur van de chromatine nooit geweest opgericht.

In de vorige studie, is het ontdekt dat zygoten een uiterst losgedraaide chromatine structuur^{3 hebben}. Op dit moment de losheid van de chromatine of openheid wordt verondersteld te zijn een belangrijke factor voor celdifferentiatie potentieel in embryonale stamcellen (ES) cellen⁴. ES-cellen homogeniteit in de natuur geen vertonen, maar zijn nogal heterogene; in de kolonies van de cel van de ES verwerven sommige Transient een hogere differentiatie mogelijkheden vergelijkbaar met blastomeren van twee cellen fase embryo’s. Tijdens deze overgang in de twee-cel als staat cellen chromatine losheid in ES verandert in wat vergelijkbaar met twee-cel fase embryo’s^{5 is}. Zo lijkt de chromatine losheid van belang voor celdifferentiatie potentieel en het is mogelijk dat uitgebreid open chromatine in zygoten is handig voor de evaluatie van zygotic ontwikkelings potentieel.

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben omdat deze methode geschikt is voor verdere ontwikkeling en zelfs voldragen ontwikkeling⁶. Als een van de levende imaging methoden, is FRAP analyse gebruikt om te onderzoeken van de chromatine losheid in voor inplanting embryo’s en ES cellen^3,4,5. Als zygotic chromatine losheid kan worden geanalyseerd zonder een schadelijk effect op voldragen ontwikkeling door FRAP analyse, kan het zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de kwaliteit van de embryo’s in het stadium van de één-cel. Echter zijn de effecten op voldragen ontwikkeling door deze experimentele methode niet onderzocht. Onlangs, een experimenteel systeem met behulp van FRAP te evalueren zygotic chromatine losheid werd ontwikkeld. Omdat dit een nieuwe waarnemingssysteem voor zygoten was, werd het genoemd als zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP beïnvloedde niet kritisch voldragen ontwikkeling en is elders⁷gemeld. In dit verslag, wordt het protocol voor deze experimentele methode beschreven.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van de dieren van het laboratorium van de Universiteit van Yamanashi. Het protocol is goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de Universiteit van Yamanashi (toestaan nummer: A24-50). Alle operaties werden uitgevoerd onder tribromoethanol narcose en inspanningen werden geleverd om het leed te minimaliseren. Een geïllustreerd overzicht van de procedures en het tijdschema worden we…

Representative Results

zFRAP analyse met eGFP-H2B MRNA codering eGFP-H2B, die wordt gezien als een verschoven band door poly een tailing (figuur 2A veroorzaakt), goed geproduceerd en werd geïnjecteerd in het cytoplasma van zygoten met een 2e polar lichaam 1-3 uur na inseminatie (figuur 2B). Acht tot 12 uur na de inseminatie, zygoten met 2 pronuclei tonen de expressie van eGFP-H2B werden verzame…

Discussion

Zoals geopenbaard in deze studie, veroorzaakt de analyse van de zFRAP geen kritische schade aan voldragen ontwikkeling, suggereert dat deze methode is een zeer nuttig instrument om te onthullen van de associatie tussen moleculaire gebeurtenissen en het embryonale ontwikkelings potentieel. Tijdens de herprogrammering, in de twee-cel als staat van ES-cellen, waardoor de differentiële potentieel van deze cellen zo hoog als die van twee cellen fase embryo’s wordt, verandert chromatine losheid in die vergelijkbaar zijn met t…

Materials

Confocal laser scaning microscope	Olympus	FV1200	FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate	Tokai Hit	TP-110RH26
Inverted microscope	Olympus	IX71
Micro manupilator	Narishige	MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator	Prime tech	PMAS-CT150
35 mm culture dish	Falcom	351008	35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish	Falcom	351007	60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish	Falcom	351006	50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish	Matsunami	D910400	50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil	Organic spceiality chemicals	625071	For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil	Sigma	M8410-1L	For IVF and embryo culture
glass capillary	Drummond	1-000-1000	For handling mouse zygotes
Borosilicate glass	Prime tech	B100-75-10-PT	For microinjection of mRNA
Micropipett puller	Sutter instrument	P-97/IVF	For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm)
Microforge	Narishige	MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit	Thermo Fisher scientific	AM1340
Poly (A) tailing kit	Thermo Fisher scientific	AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF)	IrvineSceientific	99311	HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES	Sigma	H3784
pTOPO eGFP-H2B			Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye	Thermo Fisher scientific	AM8551	For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol	nacalai tesque	25970-14
Chloroform	nacalai tesque	08401-65
Not I	TOYOBO	NOT-111X
Ethachinmate	WAKO	318-01793
3664 Otical power meter	Hioki	3664	Power meter for laser power
Stereomicmicroscope	Olympus	SZX16