Summary

Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme

Published: June 12, 2018
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Summary

Relâchement de la chromatine semble être impliquée dans le développement potentiel des blastomères. Cependant, on ne sait pas si le relâchement de la chromatine peut être utilisé comme un indice fiable pour le potentiel de développement pour les embryons. Ici, on a décrit un système expérimental dans lequel les zygotes-Evaluation de relâchement de la chromatine peuvent développer à terme.

Abstract

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse. Récemment, la chromatine desserrement ou une ouverture s’est avéré être impliqués dans le potentiel de différenciation cellulaire des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Il a été rapporté précédemment que comparé avec les cellules souches embryonnaires, zygotes hébergent une structure de la chromatine extrêmement desserrées, suggérant sa liaison avec leur totipotence. Toutefois, jusqu’à présent, il n’a pas été traitée si cette structure de la chromatine extrêmement relâché/ouvrir est importante pour les potentialités de développement embryonnaire. Dans la présente étude, afin d’examiner cette hypothèse, un système expérimental dans lequel zygotes qui ont été analysés par fluorescence récupération après blanchiment photo peut se développer à terme sans aucun dommage significatif a été développé. Ce qui est important, ce système expérimental a besoin seulement un chauffage de la thermos-plaque en plus un confocal laser scanning microscope. Les conclusions de cette étude suggèrent que le rétablissement fluorescence après que blanchiment photo analyse (PAF) de l’analyse peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires dans la chromatine zygotique sont importants pour le développement à terme.

Introduction

Après la fécondation, la structure de la chromatine est modifiée dynamiquement, et structure de la chromatine zygotique est puis finalement établie1,2. Durant cette période, dans les pronucléus paternels, la protéine dominante de la chromatine est passée de protamine en histone. La chromatine qui en résulte est extrêmement différente de celle des spermatozoïdes et des ovocytes féminins en plusieurs points (par exemple, composition variant d’histone, modification des histones). Ainsi, formé de chromatine zygotique est considérée comme important pour le développement ultérieur de l’embryon. Cependant, malgré les efforts pour révéler les détails de la structure de la chromatine zygotiques sur de longues périodes, des méthodes pour évaluer la qualité des zygotes ou pour prédire leur développement à terme au stade unicellulaire en analysant leur structure de la chromatine n’ont jamais été mis en place.

Dans l’étude précédente, il est découvert que les zygotes ont une structure de chromatine extrêmement desserré3. Actuellement, la chromatine desserrement ou une ouverture est censé être un important facteur de différenciation cellulaire potentielle de cellules souches embryonnaires (ES)4. ES cellules ne présentent pas d’homogénéité dans la nature, mais sont assez hétérogènes ; dans les colonies de cellules ES, certains acquièrent transitoirement un potentiel plus élevé de différenciation comparable à blastomères des embryons au stade de deux cellules. Au cours de cette transition dans les deux cellules comme État, relâchement de la chromatine dans ES cellules change dans ce qui est comparable avec le stade de deux cellules d’embryons5. Relâchement de la chromatine semble donc être important pour le potentiel de différenciation cellulaire et il est possible qui s’ouvrent largement la chromatine dans les zygotes est utile pour l’évaluation du potentiel de développement zygotique.

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse étant donné que cette méthode permet le développement ultérieur et même à terme développement6. Parmi les méthodes d’imagerie live, FRAP analyse a été utilisé pour examiner le relâchement de la chromatine dans les embryons préimplantatoires et ES cellules3,4,5. Si le relâchement de la chromatine zygotiques peut être analysée sans un effet néfaste sur le développement à terme par FRAP analyse, il peut être un outil précieux pour l’évaluation de la qualité des embryons au stade unicellulaire. Toutefois, les effets sur le développement à terme par cette méthode expérimentale n’ont pas été examinés. Récemment, un système d’expérimentation à l’aide de FRAP pour évaluer le relâchement de la chromatine zygotique a été développé. Parce qu’il s’agissait d’un nouveau système d’observation pour les zygotes, il a été appelé comme FRAP zygotique (zFRAP). zFRAP n’a rien à terme développement critique et a été signalée ailleurs7. Dans ce rapport, le protocole de cette méthode expérimentale est décrit.

Protocol

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Yamanashi. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Yamanashi (numéro de permis : A24-50). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie de tribromoethanol, et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances. An illustra…

Representative Results

zFRAP analyse avec eGFP-H2B Produit correctement ARNm codant pour eGFP-H2B, qui est considéré comme un groupe décalé posés par poly une traînée (Figure 2 a), a été injecté dans le cytoplasme des zygotes avec un 2ème globule polaire à 1-3 h après l’insémination (Figure 2 b). 8 à 12 h après l’insémination, les zygotes avec 2 pronucléi montrant l’expre…

Discussion

Comme l’a révélé dans cette étude, l’analyse de zFRAP ne provoque pas de dégâts critiques au développement à terme, suggérant que cette méthode est un outil très utile pour révéler le lien entre les événements moléculaires et le potentiel de développement embryonnaire. Au cours de la reprogrammation, dans les deux cellules comme état de cellules ES, par lequel le différentiel potentiel de ces cellules devient plus élevé que celui des embryons au stade de deux cellules, relâchement de la chromati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura et Kana Kishida pour fournir des commentaires critiques et support technique. Ce travail a été financé en partie par le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science and Technology programme pour promouvoir la réforme des universités nationales de M.O. ; la société japonaise pour la Promotion des sciences (16H 02593), Asada Science Foundation et la Fondation de la Science de Takeda à T.W. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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