Восстановление zygotic флуоресценции после отбеливания фото анализ для Chromatin раскованность, что позволяет полный срок развития
Summary
Раскованность хроматина, по-видимому, участвующих в потенциал развития бластомеров. Однако не известно ли хроматина раскованность может использоваться как надежный индекс на потенциал развития эмбрионов. Здесь была описана экспериментальная система, в которой может развиваться хроматина оценены раскованность зигот на полный срок.
Abstract
Живой изображений является мощным инструментом, который позволяет анализ молекулярных событий в ходе онтогенеза. Недавно чтобы участвовать в клеточной дифференциации потенциал получения эмбриональных стволовых клеток было показано хроматина неплотности или открытости. Ранее сообщалось, что по сравнению с эмбриональных стволовых клеток, зигот гавани структуру чрезвычайно ослабил хроматина, предлагая его связь с их тотипотентность. Однако до сих пор, он не рассматривался ли эта структура хроматина крайне ослаблены/открыть имеет важное значение для эмбрионального развития потенциала. В настоящем исследовании чтобы проверить эту гипотезу, была разработана экспериментальная система, в которой зигот, которые были проанализированы, флюоресценция восстановления после фото отбеливания может развиться в срок без каких-либо значительных повреждений. Важно отметить, что эта экспериментальная система требует только термос плиты утеплителя помимо конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Результаты этого исследования показывают что флуоресценции восстановления после отбеливания фото анализ (FRAP) анализ может использоваться для расследования ли молекулярные события в zygotic хроматина имеют важное значение для развития доношенных.
Introduction
После оплодотворения динамически изменяется структура хроматина, и затем в конечном итоге установленных1,2zygotic хроматина структура. В этот период, в отцовской pronuclei белок доминирующей хроматина меняется с протамина в гистонов. Результате хроматина очень отличается от спермы и женских яйцеклеток в нескольких точках (например, гистонов вариант композиции, изменения гистона). Таким образом сформированное zygotic хроматина, как считается, важное значение для последующего развития эмбриона. Однако несмотря на попытки раскрыть детали структуры zygotic хроматина длительное, методы оценки качества зигот или предсказать их полный срок развития на стадии одной ячейки, анализируя их структура хроматина никогда не были создана.
В предыдущем исследовании обнаружил, что зигот имеют чрезвычайно ослабил хроматина структура3. В настоящее время хроматина неплотности или открытости считается важным фактором для клеточной дифференциации потенциал в эмбриональных стволовых (ES) клетки4. ES клетки не проявляют однородности в природе, но довольно неоднородна; в колонии клеток ES некоторые временно приобрести выше дифференциация потенциал, сопоставимые с бластомеров двух клеточной стадии эмбриона. Во время этого перехода в двух ячейку как государство раскованность хроматина в ES клеток изменения в то, что сопоставимо с двух клеточной стадии эмбриона5. Таким образом раскованность хроматина кажется важным для клеточной дифференциации потенциал и это возможно, что широко открыть хроматина в зигот является полезным для оценки zygotic потенциал развития.
Живой изображений является мощным инструментом, который позволяет для анализа молекулярных событий в ходе онтогенеза, поскольку этот метод позволяет для последующего развития и даже полный срок развития6. Как один из живой методов обработки изображений FRAP анализ был использован для изучения хроматина неплотности в Предимплантационная эмбрионов и ES клеток3,4,5. Если zygotic хроматина раскованность могут быть проанализированы без пагубное воздействие на полный срок развития анализа FRAP, оно может быть ценным инструментом для оценки качества эмбрионы на стадии одной ячейки. Однако влияние на развитие доношенных этот экспериментальный метод не были изучены. Недавно была разработана экспериментальная система для оценки zygotic хроматина раскованность с использованием FRAP. Потому что это была новая система наблюдения для зигот, он был назван как FRAP zygotic (zFRAP). zFRAP критически не влияет на полный срок развития и был другом сообщил7. В настоящем докладе описывается протокол этого экспериментального метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как показал в этом исследовании, zFRAP анализ не повредить критического развития доношенных, предполагая, что этот метод является весьма полезным инструментом, чтобы выявить связь между молекулярные события и эмбриональных потенциал развития. Во время перепрограммирования, в двух ячейк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Satoshi Kishigami, Саяка Вакаяма, Хироаки Нагатомо, Сатоси Камимура и Кана Кисиде за критические замечания и технической поддержки. Эта работа частично финансируется министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий программы для содействия реформе национальных университетов в м.о.; Японское общество для поощрения науки (16H 02593), фонд науки Асада и Такэда научный фонд к Т.У Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
