Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Summary

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Abstract

Ons vermogen om te verkennen van eiwit-eiwitinteractie is de sleutel tot het begrijpen van regelgevende verbindingen in de cel. Detectie van eiwit-eiwitinteractie in veel gevallen is echter geassocieerd met significante experimentele uitdagingen. In het bijzonder, interageren Sorteer receptoren met hun lading van de eiwitten in het lumen van het membraan compartimenten vaak in een wasmiddel-gevoelige mode, waardoor co-immunoprecipitation van deze proteïnen onbruikbaar. Binding van het sorteren receptor sortilin aan glucose transporter die glut4 als een voorbeeld van zwakke luminal interacties tussen membraaneiwitten dienen kan. Hier beschrijven we een snelle, eenvoudige en goedkope assay voor het valideren van de interactie tussen sortilin en GLUT4. Wij hebben daarvoor ontworpen en chemisch gesynthetiseerd het myc-gelabeld peptide overeenkomt met de potentiële sortilin-bindende epitoop in het luminal deel van GLUT4. Gelabeld met zes histidines Sortilin was uitgedrukt in zoogdiercellen en geïsoleerd van cel lysates met behulp van kobalt kralen. Sortilin geïmmobiliseerd op de parels was geïncubeerd met de peptide oplossing bij verschillende pH-waarden, en het eluted materiaal werd geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Deze test kan gemakkelijk aangepast worden aan andere wasmiddel-gevoelige eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.

Introduction

GLUT4 is een glucose transporter proteïne die overwegend wordt uitgedrukt in vet en skeletale spiercellen, waar het het effect van de insuline op postprandiale bloed glucose goedkeuring¹bemiddelt. Wordt een zeer stabiele eiwitten, is GLUT4 op een posttranslationele niveau geregeld. Bij gebrek aan insuline, GLUT4 is grotendeels uitgesloten uit het plasma-membraan (vandaar lage basale permeabiliteit voor glucose) en is gelokaliseerd vooral binnen de cel in kleine insuline-responsieve blaasjes (IRVs) en trans-Golgi network (TGN) die dreigt te vertegenwoordigen de IRV donor compartiment. Op insuline toediening, de IRVs zekering met het plasma-membraan en GLUT4 leveren op de site van de werking ervan. Dit verhoogt de permeabiliteit van het plasma-membraan voor glucose, zodat dat glucose-opname uit bloed in adipocytes en skeletale myocytes 10 tot 40-fold stijgt. Na de terugtrekking van de insuline, is GLUT4 geïnternaliseerd in vroege/sorteren Endosomen en vervolgens opgehaald voor TGN waar de IRVs zich opnieuw gevormd. Beide sorteren stappen in het GLUT4 traject, d.w.z. wegnemen uit de perifere vroege Endosomen tot het perinuclear TGN, en de vorming van de IRVs op de TGN donor membranen zijn ingeschakeld door een familielid van Vps10p, sortilin, die een type vertegenwoordigt I transmembraan eiwit en een sorteer receptor. Volgens één model, sortilin werkt als een transmembraan steiger eiwit: het GLUT4 in het lumen van de Endosomen en TGN bindt, en werft adapters van de retromer of clathrin naar de cytoplasmatische kant van de donor membraan via haar C-terminus^{2, 3}. Dit vergemakkelijkt de verdeling van de GLUT4 in vesiculaire dragers die GLUT4 tussen de intracellulaire compartimenten translocate.

De interactie van de cytoplasmatische staart van sortilin met retromer en verschillende adaptor eiwitten is goed gedocumenteerd. Echter, de binding van sortilin naar GLUT4 (en op een aantal van haar andere proteïne liganden) heeft zijn uitdagend om te bewijzen. In het bijzonder, pogingen om te co-immunoprecipitate sortilin en GLUT4 niet gelukt waarschijnlijk te wijten aan het wasmiddel-gevoelige aard van de interactie tussen deze twee eiwitten. Bovendien, als een typische transporter proteïne, heeft GLUT4 12 transmembraan domeinen en 6 luminal loops elke mogelijke combinatie van die potentieel een sortilin-bindende site vertegenwoordigen kan. Op hetzelfde moment, een grote hoeveelheid indirect bewijs, zoals aanzienlijke co lokalisatie in de cel, dwarsbinding met membraan-permeabele DSP, en de interactie in gist twee hybridesysteem suggereren dat sortilin kan binden aan de GLUT4. Bovendien hebben gebruikt de laatste benadering in een combinatie met de alanine scannen mutagenese, wij eerder vastgesteld dat het domein van de Vps10p van sortilin voornamelijk aan de eerste luminal lus van GLUT4 bindt. Echter, het bewijs van een dergelijke interactie in zoogdiercellen heeft ontbroken. Hier hebben we geïsoleerd zijn-gelabeld sortilin uit cellen transfected 3T3-L1 met behulp van kobalt hars en aangetoond dat kan communiceren met chemisch gesynthetiseerde peptide overeenkomt met de eerste luminal lus van GLUT4 bij pH 6 en pH 8 die lijken op zure milieu in de endosomal lumen en neutrale omgeving in het lumen van de TGN membranen. Geen bindend peptide werd ontdekt in controle experimenten waar uittreksel bereid uit niet-transfected cellen was geladen op de dezelfde parels.

Protocol

1. het hanteren van de Peptide Ontwerpen en bestellen van de peptide Kies de gewenste volgorde van de peptide en toevoegen van een tag, zoals myc epitope (EQKLISEED) op haar beide N – of C-terminus. Controleer de voorspelde oplosbaarheid van de peptide in water, met behulp van peptide oplosbaarheid rekenmachine http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Als de oplosbaarheid laag is, probeert toe te voegen een andere in water oplosbare tag als de balans van de kosten wilt wijzigen.<…

Representative Results

Lysates waren bereid uit 3T3 L1 cellen transfected stabiel met Sortilin-myc/zijn5 en uit WT 3T3 L1 cellen, gebruikt als een negatieve controle. Beide lysates werden geïncubeerd met kobalt kralen op pH 6 of pH 8 en grondig gewassen. Kralen met geïmmobiliseerdet eiwitten werden vervolgens geïncubeerd in de oplossing van Myc-fll-Glut4. Na voorzichtig wast, werden eiwitten gebonden aan de parels geëlueerd met 0,25 M imidazool. Monsters werden blootgesteld, samen me…

Discussion

Sortilin is een evolutionaire Geconserveerde proteïne van de multi ligand-receptor die betrokken is in beide signalering op het plasma-membraan en intracellulaire Sorteer gebeurtenissen^6,7. De zoektocht naar de authentieke sortilin liganden (waarvan sommige zijn luminal of integraal membraaneiwitten) is echter ingewikkeld als de interactie van sortilin met een aantal van haar partners bindende lijkt te zijn gevoelig voor detergentia. Daarom een eenvoudig en een …

Materials

Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8849	for use in purification of histidine tag protein
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Insulin Syringe U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23228
Wash buffer	Boston BioProducts	BP-234	For His-tag protein purification
HisPur Cobalt Resin	Thermo Scientific	89964
Tricine sample Buffer	Bio-Rad	161-0739	with SDS, bMercaptaethanol should be added
Elution  Buffer	Boston BioProducts	BP-236	For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%	Bio-Rad	456-3115	For seperation of peptide and small protein
Tris/Tricine/SDS running buffer	Bio-Rad	161-0744
Transfer Buffer	Boston BioProducts	BP-190	Add 20% methanol
Nitrocellulose membrane  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc antibody	Cell Signaling	2272	Rabbit
Peptide	Genscipt		customize ordering
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374