Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки
Summary
Мы описываем протокол для обнаружения моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранных белков с помощью связывания рецептора сортировки, sortilin, в первый цикл Люминал белка транспортера глюкозы, GLUT4, в качестве примера.
Abstract
Наша способность исследовать белок белковых взаимодействий является ключом к пониманию нормативных соединения в ячейке. Однако обнаружение белок белковых взаимодействий во многих случаях связано с значительным экспериментальных задач. В частности сортировки рецепторов взаимодействуют с их белков груз в просвете мембраны отсеков часто в моющих средств чувствительных Мода, делая co иммунопреципитация этих белков непригодным для использования. Связывание сортировки sortilin рецептор для транспортера глюкозы, что GLUT4 может служить примером слабых Люминал взаимодействий между мембранных белков. Здесь мы описываем быстрый, простой и недорогой пробирного для проверки взаимодействия между sortilin и GLUT4. Для этого мы разработали и химически синтезированных myc тегами пептид, соответствующие потенциальные sortilin привязки epitope Люминал частью GLUT4. Sortilin, отмеченных 6 гистидинов была выражена в mammalian клетках и изолированы от lysates клетки с использованием кобальта бусины. Sortilin, иммобилизованных на бисер был инкубировали с пептидной решения в различных рН, и eluted материал был проанализирован Западный blotting. Этот assay может быть легко адаптирована для изучения других моющих средств чувствительных белок белковых взаимодействий.
Introduction
GLUT4 — это белок транспортера глюкозы, которая выражается главным образом в жира и скелетных мышечных клеток, где он опосредует влияние инсулина на пост натощак крови глюкозы Распродажа1. Будучи очень стабильного белка, GLUT4 регулируется на столб-поступательные уровне. В отсутствие инсулина, GLUT4 значительной степени исключены из плазматической мембраны (отсюда низкая базальная проницаемость для глюкозы) и локализуется преимущественно внутри клетки в небольших инсулин отзывчивым везикулы (IRVs) и транс Гольджи сети (TGN), которая может представлять IRV доноров отсек. После инсулина администрации IRVs предохранитель с плазматической мембраны и доставить GLUT4 на сайт своего функционирования. Это увеличивает проницаемость мембраны плазмы для глюкозы, так что поглощение глюкозы из крови в адипоциты и скелетные миоциты возрастает с 10 до 40. После ухода инсулина GLUT4 включены в начале/сортировка endosomes и затем извлечь TGN, где IRVs вновь сформированных. Оба сортировки шаги в GLUT4 путь, т.е. извлечение из периферийных раннего endosomes для perinuclear TGN и формирование IRVs на доноров TGN мембраны включены членов семьи Vps10p, sortilin, который представляет тип I трансмембранный белок и сортировки рецептора. По словам одной модели, sortilin работает как белка трансмембранного эшафот: он связывает GLUT4 в просвете endosomes и TGN и нанимает адаптеров retromer или Клатрин цитоплазматических сторону доноров мембраны через его C-конечная2, 3. Это облегчает распространение GLUT4 в везикулярного перевозчиков, которые перемещают GLUT4 между внутриклеточным отсеков.
Взаимодействие цитоплазматических хвост sortilin с retromer и различных адаптер белков хорошо задокументировано. Однако связывание sortilin GLUT4 (и некоторые из его других лигандов белка) было сложно доказать. В частности попытки co-immunoprecipitate sortilin и GLUT4 не были успешно вероятно из-за моющих средств чувствительных характер взаимодействия между этими двумя белков. Кроме того, как типичный транспортер белок GLUT4 имеет 12 трансмембранных доменов и просветный 6 петель любое сочетание которых потенциально могут представлять sortilin привязки сайта. В то же время большой объем косвенных доказательств, например значительное совместное локализации в ячейке, сшивки с проницаемой мембраны DSP, а также взаимодействие в дрожжей два гибридной системы показывают, что sortilin можно привязать к GLUT4. Кроме того используя последний подход в сочетании с аланина, сканирование мутагенеза, мы ранее определили, что домен Vps10p sortilin связывается главным образом первый Люминал петля GLUT4. Однако доказательства такого взаимодействия в mammalian клетках был пропавших без вести. Здесь, мы выделили его меткой sortilin из transfected 3T3-L1 клеток с использованием кобальта смолы и продемонстрировал, что он может взаимодействовать с химически синтезированных пептидов, соответствующий первой Люминал цикла GLUT4 на pH 6 и рН 8, напоминающие кислой среды в от англ люмен и нейтральной среде в просвете TGN мембран. Привязка не пептид был обнаружен в управления экспериментов, где экстракт, приготовленный из не transfected клеток был загружен на же бисер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin-это эволюционный сохранение нескольких лигандов белка рецептора, что участвует в обоих сигналов на плазматической мембраны и внутриклеточных сортировки событий6,7. Однако поиск подлинных sortilin лигандами (некоторые из которых являются Люминал или со…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательских грантов, DK52057 и DK107498 из низ K.V.K. Х.Р был поддержан институционального обучения Грант 2T32DK007201 из низ.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
