Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti
Summary
Biz algılama deterjan-duyarlı sıralama reseptör, sortilin, GLUT4, glukoz taşıyıcı protein ilk luminal döngü için bağlama örnek olarak kullanarak zar proteinleri arasında bir köprü işlevi için bir iletişim kuralı tanımlamak.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri keşfetmek için bizim yetenek hücredeki düzenleme bağlantılarını anlama anahtarıdır. Ancak, protein-protein etkileşimler birçok durumda tespiti önemli deneysel sorunlar ile ilişkilidir. Özellikle, sıralama reseptörleri kez deterjan duyarlı moda co-immunoprecipitation bu proteinlerin kullanılamaz yapar, membran bölmeleri Lümen içinde onların protein kargo ile etkileşim. Sıralama reseptör sortilin GLUT4 membran proteinlerinin arasındaki zayıf luminal etkileşimlerin bir örnek olarak hizmet verebilir glikoz taşıyıcı için bağlama. Burada, sortilin ve GLUT4 arasındaki etkileşimi doğrulamak için hızlı, basit ve ucuz bir tahlil açıklayın. Bunun için biz tasarladık ve kimyasal potansiyel sortilin bağlama epitope GLUT4 luminal kısmında karşılık gelen myc öğesini peptid sentez. Tagged ile altı histidines Sortilin memeli hücrelerinde ifade ve kobalt boncuk kullanarak hücre lysates izole. Üstündeki immobilize Sortilin peptid çözüm farklı pH değerlerinde ile inkübe ve eluted malzeme Western Blot tarafından analiz edildi. Bu tahlil diğer deterjan duyarlı protein-protein etkileşimleri çalışmaya kolayca adapte edilebilir.
Introduction
GLUT4 nerede insülin etkisi sonrası prandial kan glikoz izni1aracılık eder yağ ve kas hücrelerinde ağırlıklı olarak gösterilen bir glikoz taşıyıcı proteindir. Çok istikrarlı bir protein olmak, GLUT4 translasyon düzeyinde düzenlenir. İnsülin yokluğunda GLUT4 büyük ölçüde plazma membran (dolayısıyla düşük Bazal geçirgenliği glikoz için) gelen söz konusu değildir ve küçük insülin duyarlı veziküller (IRVs) hücre içinde ağırlıklı olarak yerelleştirilmiştir ve temsil etmek büyük olasılıkla trans-Golgi ağ (TGN) Irv donör bölüm. İnsülin yönetim, üzerine IRVs plazma zarı ile sigorta ve işleyişi siteye GLUT4 teslim. Bu glikoz alımı adiposit ve iskelet miyositler kandan 10’a 40-fold yükselir böylece bu glikoz, plazma membran geçirgenliği artar. İnsülin çekilme sonra GLUT4 erken/sıralama endosomes içselleştirilmiş ve IRVs yeniden kurulan nerede TGN alındı. Her iki sıralama adımlar GLUT4 yolu, Yani çevresel erken endosomes tarafından ulaşım perinükleer TGN için ve IRVs oluşumu üzerinde membranlar Vps10p aile üyesi tarafından bir türü temsil eden sortilin, etkin TGN donör ben transmembran protein ve sıralama reseptör. Bir modeline göre sortilin bir transmembran iskele protein çalışır: GLUT4 endosomes ve TGN Lümen bağlar ve onun C-terminus2, retromer veya clathrin adaptörler donör membran aracılığıyla sitoplazmik tarafına acemi 3. bu GLUT4 dağıtım GLUT4 hücre içi bölmeleri arasında translocate veziküler taşıyıcıları içine kolaylaştırır.
Sortilin sitoplazmik kuyruk retromer ve çeşitli adaptör proteinler ile etkileşim iyi belgelenmiş oldu. Ancak, sortilin GLUT4 (ve onun diğer protein ligandlar birkaç) bağlantısını kanıtlamak için zor oldu. Özellikle, co-immunoprecipitate sortilin ve GLUT4 girişimlerini muhtemelen bu iki proteinler arasındaki etkileşimi deterjan duyarlı olması nedeniyle başarılı olmamıştır. Ayrıca, bir tipik taşıyıcı protein olarak GLUT4 12 transmembran etki alanları ve 6 luminal döngüler hangi herhangi bir bileşimini potansiyel bir sortilin bağlama site temsil edebilir vardır. Aynı zamanda, membran geçirgen DSP ve etkileşim ile Maya iki hibrid sistemde cross-linking önemli ortak yerelleştirme hücresinde, gibi dolaylı kanıtların büyük bir vücut önermek o sortilin GLUT4 için bağlayabilirsiniz. Ayrıca, ikinci yaklaşımı mutagenesis tarama alanin ile bir arada kullanarak, biz daha önce sortilin Vps10p etki öncelikle GLUT4 ilk luminal döngüsünü için bağlar belirledik. Ancak, böyle bir etkileşim memeli hücreleri olarak kanıtı kayıp olmuştur. Burada, asidik ortamda benzer O’nun öğesini sortilin kobalt reçine kullanarak ve kimyasal olarak sentezlenmiş peptid GLUT4 ilk luminal döngü pH 6 ve pH 8 karşılık gelen ile etkileşim kurabilir gösterdi transfected 3T3-L1 hücreleri izole ettim endosomal Lümen ve TGN membranlar nötr ortam Lümen içinde. Hiçbir peptid bağlama denetimi deneylerde nerede sigara transfected hücrelerden hazırlanan özü aynı boncuk dolu olduğunu tespit edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin her iki sinyal plazma zarı ve hücre içi sıralama olaylar6,7dahil bir evrimsel korunmuş çok ligand protein reseptörü var. Ancak, deterjanlar için duyarlı olmak sortilin etkileşim bazı bağlama ortakları ile göründüğü gibi otantik sortilin’ın ligandlar (bazıları luminal veya integral membran proteinlerinin olan) için arama karmaşıktır. Bu nedenle, bir kolay ve protein-protein etkileşimleri, türleri çalışmak için yaygın bir y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser DK52057 ve K.V.K. X.P için gelen NIH DK107498 kurumsal eğitim grant 2T32DK007201 NIH üzerinden tarafından desteklenen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
