세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지
Summary
우리는 세제에 민감한 예를 들어 정렬 수용 체, sortilin, GLUT4, 포도 당 운송업 자 단백질의 첫 번째 luminal 루프의 바인딩을 사용 하는 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
단백질 단백질 상호 작용을 탐구 하는 능력은 셀에 규제 연결을 이해 하는 열쇠. 그러나, 많은 경우에 단백질-단백질 상호 작용의 중요 한 실험 과제와 연결 됩니다. 특히, 정렬 수용 체 그들의 단백질 화물이이 단백질의 공동-immunoprecipitation을 사용할 수 없게 만드는 세제에 민감한 패션에서 자주 막 구획의 루멘에서 상호 작용 합니다. 포도 당 운송업 자 GLUT4 약한 luminal 상호 막 단백질의 한 예로 봉사 수로 정렬 수용 체 sortilin의 바인딩. 여기, 우리는 sortilin 및 GLUT4 사이의 상호 작용을 확인 하기 위해, 간단한, 빠르고 저렴 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 설계 및 GLUT4 luminal 부분에 잠재적인 sortilin 바인딩 epitope를 해당 myc 태그 펩타이드를 화학적으로 합성. Sortilin 6 히스티딘 태그로 포유류 세포에 표현 되었고 세포 lysates 코발트 비즈를 사용 하 여에서 격리. Sortilin 구슬에 움직일 수 다른 pH 값, 펩 티 드 솔루션으로 알을 품는 그리고 서쪽 blotting에 의해 eluted 자료 분석. 이 분석 결과 다른 세제에 민감한 단백질-단백질 상호 작용 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
GLUT4 지방과 골격 근육 세포 그것 후 높은가격순 혈액 포도 당 정리1에 인슐린의 효과 중재 하는 곳에 주로 표현 되는 포도 당 운송업 자 단백질 이다. 매우 안정적인 단백질 이기 때문에, GLUT4 닢 수준에 통제 된다. 인슐린의 부재에 GLUT4 크게 원형질 막 (포도 당에 대 한 따라서 낮은 기저 침투성)에서 제외 되 고 주로 셀 내부를 작은 인슐린 응답 소포 (IRVs)에서 지역화 및 trans Golgi 네트워크 (TGN) 나타낼 수 있는 어브 기증자 구획입니다. 인슐린 관리 시는 IRVs 원형질 막으로 융합 하 고 그 작동의 사이트에 GLUT4를 제공 합니다. 그래서 adipocytes 및 골격 myocytes 혈액에서 포도 당 통풍 관 그 상승 10 ~ 40이 혈당, 원형질 막의 침투성을 증가 합니다. 인슐린 철수 후 GLUT4 초기/정렬 endosomes에 내 고 검색 TGN는 IRVs는 다시 형성 하. 두 정렬 단계 GLUT4 통로, 즉 주변 초기 endosomes에서 perinuclear TGN을 검색에는 IRVs의 대형 막 Vps10p 가족, 형식을 나타내는 sortilin에 의해 활성화 되어 TGN 기증자에 나 막 횡단 단백질 그리고 정렬 수용 체입니다. Sortilin 비 계 막 횡단 단백질으로 작동 하는 하나의 모델에 따르면: 그것은 GLUT4 endosomes의 TGN, 루멘에 바인딩하고 신병은 기증자 막 통해 의 세포질 측에 retromer 또는 clathrin 어댑터의 C-터미널2, 3. 세포내 구획 사이 GLUT4 이동 기공을 사업자에 GLUT4의 배포를 용이 하 게이.
Retromer와 다양 한 접합 기 단백질 sortilin의 세포질 꼬리의 상호 작용을 잘 문서화 되었습니다. 그러나, sortilin GLUT4 (와 몇몇의 다른 단백질 ligands)의 바인딩 증명 하기 위해 도전 하고있다. 특히, 공동 immunoprecipitate sortilin 및 GLUT4 하려고가 두 단백질 사이 상호 작용의 세제에 민감한 특성상 아마 성공 되지 않았습니다. 또한 일반 운송업 자 단백질 GLUT4 12 막 횡단 도메인 및 6 luminal 루프는 조합 잠재적으로 sortilin 바인딩 사이트를 나타낼 수 있다. 동시에 효 모 2 잡종 시스템에 막 침투성 DSP와 상호 작용 cross-linking 셀에 실질적인 공동 지역화 등 간접 증거의 큰 몸 그 sortilin GLUT4 바인딩할 수 있는 것이 좋습니다. 또한, mutagenesis 스캔 알라닌과 조합에서 후자의 방식을 사용 하 여 우리는 이전 결정 sortilin의 Vps10p 도메인 주로 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 바인딩합니다. 그러나, 포유류 세포에 이러한 상호 작용의 증거는 실종 되었습니다. 여기, 우리 산 성 환경에서 유사한 transfected 3T3-L1 셀 코발트 수 지를 사용 하 여 pH 6 및 pH 8에 GLUT4의 첫 번째 luminal 루프에 해당 하는 화학적으로 합성된 펩 티 드와 상호 작용할 수 있는 증명에서 그의 태그 sortilin 격리는 endosomal 루멘 그리고 TGN 막의 루멘에서 중립 환경. 아니 펩 티 드 바인딩 비 transfected 세포에서 준비 된 추출 물 같은 구슬에 로드 된 컨트롤 실험에서 발견 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin는 진화 보존된 멀티 ligand 단백질 수용 체 세포내 정렬 이벤트6,7와 원형질 막에 두 신호에 관련 된 이다. 그러나, 정통 sortilin의 ligands (일부는 luminal 또는 완전 한 막 단백질)에 대 한 검색은 복잡 하다 바인딩 파트너의 일부와 함께 sortilin의 상호 작용 세제에 민감한 것 같다. 따라서, 쉽게 그리고 단백질 단백질 상호 작용, 공부에 대 한 광범위 한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DK52057 및 K.V.K. X.P에 NIH에서 DK107498는 NIH에서 제도적 교육 부여 2T32DK007201에 의해 지원 되었다 연구 보조금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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