Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen
Summary
Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.
Abstract
Dendritische cellen (DC) zijn heterogene cel populaties die in hun markeringen van de celmembraan, migratiepatronen en distributie, en in hun antigeen presentatie en T-cel activatie capaciteiten verschillen. Aangezien de meeste vaccinaties van experimentele tumor modellen miljoenen DC vereisen, zijn ze wijd geïsoleerd uit het beenmerg of milt. Deze DC verschillen echter aanzienlijk van bloed en tumor DC in hun reacties immuuncomplexen (IC), en vermoedelijk aan andere lectine unnethes-coupled receptoren. Nog belangrijker is, gezien de gevoeligheid van DC naar gevaar-geassocieerde moleculen, de aanwezigheid van endotoxines of antilichamen die dwarslijn activering receptoren in één van de isoleren stappen kan resulteren in de priming voor DC en dus invloed op de parameters, of ten minste de dosering, nodig om ze te activeren. Daarom beschrijven hier we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van MoDC uit bloed en tumoren terwijl het vermijden van hun voortijdige activering. Daarnaast vindt u een protocol voor MoDC activering met tumor IC en hun latere analyses.
Introduction
Dendritische cellen (DC) hebben sinds hun ontdekking, een focus van uitgebreid onderzoek vanwege hun unieke vermogen om T cel differentiatie1scheef. In de afgelopen decennia, heeft een uitgebreide onderzoeksinspanning willen definiëren van de diverse subsets van de DC en hun functie tijdens de progressie van de tumor en immuniteit 2. DCs bestaan uit heterogene cel populaties die van elkaar in hun patroonherkenning receptoren, weefsel distributie verschillen, en trekvogels en antigeen presentatie mogelijkheden3,4,5. In vergelijking met de andere DC deelverzamelingen, monocyt-afgeleide DC (MoDC) zijn veel meer overvloedig in tumoren en kan gemakkelijk worden gegenereerd vanuit het circulerende of tumor-infiltreren monocyten6,,7. Dus, veel klinische proeven die willen profiteren van hun relatieve prevalentie zijn gebaseerd op de in vivo en ex vivo manipulatie van autologe MoDC om te ontlokken van T-cel-immuniteit 8,9.
Evenzo, DC-gebaseerde vaccinatie van het experimentele tumor modellen vereist 2-3 seriële injecties, 5-7 dagen uit elkaar, voor 1-2 x 106 geactiveerde DC met tumor-antigenen gepulseerde. Daarom, om te bereiken deze groot aantal DC, meeste muis studies hebben voornamelijk gebruikt MoDC gekweekt uit het beenmerg (BM) precursoren in GM-CSF voor 7-9 dagen (IL-4 niet nodig is in de muisinstelling van de)10,11. Echter heeft gezien dat GM-CSF knock-out muizen hebben over het algemeen normale DC compartiment- 12,13, en gezien de gemengde bevolking verkregen uit die cultuur,14 de fysiologische relevantie van deze DC in twijfel getrokken.
DC kan als alternatief worden routinematig geïsoleerd uit cellen van de milt. Echter, DC omvatten slechts ongeveer 0.3-0.8% van totale milt cellen (wat resulteert in ongeveer 7 x 105 DC/milt), en deze cellen, alleen CD103+ DC en MoDC kunt migreren naar de lymfoïde organen. Aangezien MoDCs ongeveer 10-15% van de milt DC populaties15,16 omvatten, rendement meeste protocollen van de isolatie ongeveer 1 x 105 MoDC per milt. Uitbreiding van MoDC kan worden bereikt door het injecteren van transfected cellen B16 die afscheiden van GM-CSF, wat resulteert in een toename van de milt MoDC17100-fold. Het gebruik van MoDC voor het ontwikkelen van DC vaccins is echter beperkt omdat deze procedure niet kan worden gedaan in de mens en de verkregen MoDC zijn al sterk geactiveerd.
Naast het verkrijgen van voldoende aantallen DC, betekent een andere uitdaging voor de ontwikkeling van effectieve DC vaccins tegen autologe kankercellen het ontbreken van voldoende gevaar signalen in de omgeving van de tumor volledig activeren DC. Inductie van co-stimulatory signalen wordt meestal bereikt door activering van patroonherkenning receptoren (PRR), of c-type lectine signalering trajecten18,19,20,21. Een verdere aanpak voor het activeren van DC exploiteert hun vermogen tot het nemen van antigenen door middel van interacties met oppervlakte Fcγ receptoren (FcγR). Inderdaad, een aantal belangrijke manuscripten hebben aangetoond dat injectie van MoDC van BM precursors geactiveerd met tumor-IgG IC tumorgroei in profylactische instellingen kunnen voorkomen, en kan leiden tot de uitroeiing van gevestigde tumoren22,23 .
In twee recente artikels ontdekte Carmi et al. dat in tegenstelling tot BMDC en milt DC, MoDC van het bloed en de tumoren kan niet op IgG IC zonder extra prikkels reageren. Dit bleek te zijn door de aanwezigheid van hoge intracellulaire niveaus van tyrosine fosfatases FcγR signalering van24,25te reguleren. Door het definiëren van een kritisch controlepunt in DC, verstrekt dit werk een belangrijk inzicht verschaffen in de vereisten voor succesvolle DC-gebaseerde vaccinatie. De eis van aanvullende stimuli om FcγR signalering en vermoedelijk signalering van andere lectine receptoren met gebruikmaking van een soortgelijk fosforylatie cascade, aldus onderstreept de noodzaak voor het vermijden van de priming voor DC tijdens hun isolement.
Daarom dit protocol beschrijft de isolatie van de MoDC uit het bloed en tumoren, die aanzienlijk van BM en milt DC afwijken, en hoogtepunten van voorzorgsmaatregelen tijdens het overwegen waard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezien het grote aantal DC vereist voor het vaccineren van muizen (ongeveer 2-4 x 106 DC per één muis), allermeest naar de vaccinatie strategieën in muizen zijn gebaseerd op isolatie van DC van BM en milt gevolgd door hun ex vivo -activering. Echter probeert te activeren tumor DC in vivo, met behulp van dezelfde voorwaarden voor het activeren van de milt en BM DC, vaak niet succesvol in het produceren van effectieve immuniteit geweest. In twee latere publicaties, Carmi et al. hebb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
