Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos
Summary
Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.
Abstract
Células dendríticas (DC) são populações de células heterogêneas que diferem em seus marcadores de membrana celular, padrões de migração e distribuição e em sua apresentação de antigénios e capacidades de ativação de células T. Desde que a maioria das vacinas de modelos experimentais de tumor exigem milhões de DC, são amplamente isolados da medula óssea ou baço. No entanto, estes DC significativamente diferem sangue e tumor DC nas suas respostas aos complexos imunes (IC) e presumivelmente a outros receptores de lectina Syk-acoplado. Importante, dada a sensibilidade da DC para moléculas associadas a perigo, a presença de endotoxinas ou anticorpos que crosslink receptores de ativação em um do isolando passos poderia resultar de escorva DC e, assim, afetar os parâmetros, ou pelo menos a dosagem, necessária para ativá-los. Portanto, aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar MoDC de sangue e tumores, evitando sua ativação prematura. Além disso, um protocolo é fornecido para ativação MoDC com tumor IC e suas análises subsequentes.
Introduction
Desde a sua descoberta, as células dendríticas (DC) têm sido um foco de pesquisa extensa devido à sua capacidade única de inclinar a diferenciação de células T1. Ao longo das últimas décadas, buscou-se um esforço de pesquisa extensiva definir os vários subconjuntos de DC e sua função durante a progressão do tumor e imunidade 2. DCs são compostas de populações de células heterogêneas que diferem entre si em seus receptores de reconhecimento de padrões, distribuição tecidual, e migratórias e antígeno apresentação recursos3,4,5. Comparado a outros subconjuntos de DC, DC derivados de monócitos (MoDC) são muito mais abundante em tumores e podem ser facilmente gerados a partir de circulação ou tumor infiltrando monócitos6,7. Portanto, muitos ensaios clínicos procuram se aproveitar de sua prevalência relativa baseiam-se na manipulação in vivo e ex vivo de MoDC autólogo para eliciar a célula T imunidade 8,9.
Da mesma forma, a vacinação baseada em DC de modelos experimentais de tumor requer injeções seriais de 2-3, 5-7 dias de diferença, de 1-2 x 106 registrado DC pulsado com antígenos do tumor. Portanto, para alcançar este grande número de DC, a maioria dos estudos de rato ter usado principalmente MoDC cultivada de precursores da medula óssea (BM) em GM-CSF para dias 7-9 (IL-4 não é necessário na configuração do mouse)10,11. No entanto, dado que nocaute de GM-CSF, os ratos têm total normal DC compartimento 12,13e dado as populações mistas obtidas essa cultura,14 a relevância fisiológica destes DC tem sido posta em causa.
Alternativamente, a DC pode ser rotineiramente isolado de células de baço. No entanto, DC compreendem apenas cerca de 0,3-0,8% de células de baço total (resultando em cerca de 7 x 105 DC/baço) e destas células, apenas CD103+ DC e MoDC podem migrar para órgãos linfoides. Desde que MoDCs representam cerca de 10-15% de esplênica DC populações15,16, a maioria dos protocolos de isolamento rendem aproximadamente 1 x 105 MoDC por baço. Expansão de MoDC pode ser alcançado através da injeção de células transfectadas do B16 que secretam GM-CSF, resultando em um aumento de 100 vezes no esplênica MoDC17. No entanto, o uso de MoDC para o desenvolvimento de vacinas de DC é limitado, desde que este procedimento não pode ser feito em seres humanos e os obtidos MoDC já altamente são ativados.
Além de obter números adequados de DC, outro desafio para o desenvolvimento de vacinas DC eficazes contra células cancerígenas autólogas envolve a falta de sinais de perigo suficiente no cenário de tumor para ativar completamente DC. Indução de sinais co-estimulatória geralmente é conseguida através da ativação de receptores de reconhecimento de padrões (PRR), ou lectina tipo c sinalização percursos18,19,20,21. Uma abordagem mais para ativar DC explora sua capacidade para assumir a antígenos através de interações com receptores de superfície Fcγ (FcγR). Com efeito, um número de manuscritos importantes têm demonstrado que a injeção de MoDC de precursores BM ativado com tumor-IgG IC pode impedir o crescimento do tumor em configurações profiláticas e pode levar à erradicação dos tumores estabelecido22,23 .
Em dois trabalhos recentes, Carmi et al descobriram que em contraste com BMDC e baço DC, MoDC pelo sangue e tumores não pode responder a IgG IC sem estímulos adicionais. Isto foi encontrado para ser devido à presença de altos níveis intracelulares de fosfatases de tirosina regulação FcγR sinalização24,25. Definindo um ponto de controle crítico no DC, este trabalho forneceu uma visão importante sobre os requisitos de vacinação bem sucedida baseada em DC. A exigência de estímulos adicionais habilitar FcγR, sinalização e presumivelmente sinalização de outros receptores de lectina utilizando uma cascata de fosforilação semelhante, assim ressalta a necessidade de evitar a escorva da DC durante seu isolamento.
Portanto, o presente protocolo descreve o isolamento de MoDC do sangue e tumores, que diferem marcadamente de BM e baço DC, e destaca as precauções vale a pena considerar durante o processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dado o grande número de DC necessário para vacinar os ratos (aproximadamente 2-4 x 106 DC por um rato), a maioria da vacinação estratégias em camundongos baseiam-se no isolamento de DC do BM e do baço, seguido por sua ativação ex vivo . No entanto, tenta ativar tumor DC em vivo, usando as mesmas condições para ativar o baço e BM DC, muitas vezes ter sido mal sucedido em produzir imunidade eficaz. Em duas publicações subsequentes, Carmi et al. descobriram que sangue e tum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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