בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול
Summary
נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.
Abstract
תאים דנדריטים (DC) הם אוכלוסיות הטרוגניות תא שונים שלהם סמני קרום התא, דפוסי ההגירה והפצה, וכן מצגת אנטיגן ויכולות הפעלה תא T שלהם. מאז החיסונים רוב הגידול ניסיוני מודלים דורש מיליוני DC, הם נרחב שבודד מח העצם או הטחול. עם זאת, אלה DC באופן משמעותי נבדלים דם, גידול DC בתגובות שלהם מכלולי המערכת החיסונית (IC), ככל הנראה קולטנים לקטין מצמידים Syk אחרים. חשוב, שגבה את הרגישות של DC מולקולות הקשורים סכנה, הנוכחות של endotoxins או נוגדנים crosslink הפעלת קולטנים באחד לבודד שלבים יכול לגרום לקרקע של DC, ובכך להשפיע על הפרמטרים, או לפחות המינון, הנדרש כדי להפעיל אותם. לכן, כאן אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור בידוד MoDC דם, גידולים תוך הימנעות הפעלה מוקדמת שלהם. בנוסף, פרוטוקול מסופק עבור הפעלת MoDC עם גידול IC, וניתוחים הבאים שלהם.
Introduction
מאז גילוין, תאים דנדריטים (DC) יש מוקד מחקר מקיף עקב יכולתם ייחודי להטות את תא T בידול1. בעשורים האחרונים, מאמץ מחקר מקיף ביקש להגדיר תת-קבוצות DC השונים ואת תפקידם במהלך התקדמות הגידול, חסינות 2. בקרי קבוצת מחשבים מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות תא נבדלים אחד מהשני שלהם רצפטורים זיהוי תבניות, רקמות הפצה, נודדים ל אנטיגן הצגת יכולות3,4,5. לעומת קבוצות משנה אחרים DC, DC נגזר מונוציט (MoDC) הם הרבה יותר בשפע גידולים ו ניתן להפיק בקלות של מחזורי או גידולים הסתננות ומונוציטים6,7. לכן, מחקרים קליניים רבים המבקשים לנצל את השכיחות היחסית שלהם מבוססים על מניפולציה ויוו ו- ex-vivo של MoDC עצמיים כדי להפיק תא T חסינות 8,9.
באופן דומה, מבוסס-DC חיסון ניסיוני הגידול מודלים דורש זריקות טורי 2-3, 5-7 ימים בנפרד, של 1-2 x 106 DC מופעל פעמו עם גידול אנטיגנים. לכן, כדי להשיג את מספר גדול של DC, רוב המחקרים העכבר יש בשימוש בעיקר MoDC תרבותי של מח העצם (מוניטור) סימנים מקדימים ב- GM-CSF 7-9 ימים (IL-4 אין צורך בהגדרת העכבר)10,11. למרות זאת, בהתחשב מהממת GM-CSF עכברים יש בסך הכל נורמלי DC תא 12,13, וקיבל את אוכלוסיות מעורבות המתקבל התרבות הזו, כבר נקרא14 הרלוונטיות פיזיולוגיים של DC אלה לתוך השאלה.
לחלופין, DC עשויים להיות מבודד באופן שגרתי מתאי הטחול. עם זאת, DC מהווים רק כ 0.8-0.3% של תאי הטחול הכולל (וכתוצאה מכך כ 7 x 105 DC/טחול), ואת אלו תאים, רק CD103+ DC ו- MoDC יכול להעביר בחזרה אל איברי הלימפה. מאז MoDCs מהווים כ- 10-15% של הטחול DC אוכלוסיות15,16, ברוב הפרוטוקולים בידוד תשואה כ עונה 1 פרק 105 MoDC לכל הטחול. הרחבה של MoDC יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת transfected B16 תאים להפריש GM-CSF, וכתוצאה מכך עלייה 100-fold MoDC הטחול17. עם זאת, השימוש MoDC לפיתוח חיסונים DC מוגבל שכן הליך זה לא יכול להיעשות בני אדם, רכש את MoDC כבר מאוד מופעלים.
בנוסף לקבלת נאותה מספרים של DC, אתגר נוסף על פיתוח חיסונים יעילים DC נגד תאים סרטניים עצמיים כרוך העדר מספיק אותות סכנה בהגדרת הגידול להפעיל באופן מלא DC. אינדוקציה של אותות co-stimulatory מושגת בדרך כלל באמצעות הפעלה של זיהוי תבנית קולטנים (PRR), או c-type לקטין איתות המסלולים18,19,20,21. גישה נוספת להפעלת DC מנצלת את היכולת שלהם תופסים אנטיגנים דרך אינטראקציות עם רצפטורים Fcγ פני השטח (FcγR). ואכן, מספר כתבי יד חשובים הראו כי הזרקה של MoDC מ מבשרי מוניטור מופעל עם הגידול-אג IC יכול למנוע את צמיחת הגידול בהגדרות מניעתי, והוא יכול להוביל מיגור של גידולים הוקמה22,23 .
בשני העיתונים האחרונות, כרמי ואח גילה כי בניגוד BMDC וה טחול DC, MoDC דם, גידולים יכולים. להגיב IC אג ללא גירויים נוספים. זה נמצא להיות בשל נוכחותם של רמות גבוהות תאיים של ויסות FcγR איתות24,25phosphatases טירוזין. על-ידי הגדרת מחסום קריטי בוושינגטון, עבודה זו מספק תובנה חשובה הדרישות לקבלת חיסון מבוסס-DC מוצלח. הדרישה גירויים נוספים לאפשר FcγR איתות, ככל הנראה איתות של רצפטורים אחרים לקטין ניצול מפל זרחון דומה, ובכך מדגיש את הצורך הימנעות לקרקע של DC במהלך הבידוד שלהם.
לכן, בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של MoDC דם, גידולים, אשר נבדלים במידה ניכרת BM וה טחול DC, ואור אמצעי זהירות שכדאי לשקול במהלך התהליך.
Protocol
Representative Results
Discussion
נתון מספר גדול של DC נדרש חיסון עכברים (כ 2-4 x 106 DC לכל עכבר אחד), רוב החיסון אסטרטגיות בעכברים מבוססים על בידוד של DC מ BM וה טחול ואחריו הפעלה שלהם ex-vivo . עם זאת, מנסה להפעיל את הגידול DC ויוו, משתמש באותם התנאים להפעלת הטחול ו- DC מוניטור, לעיתים קרובות לא הצליחו לייצר חסינות יעיל. בפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אף אחד
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
