마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Summary

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

수지상 세포 (DC)는 이종 세포 인구에 그들의 세포 막 마커, 마이그레이션 패턴 및 유통, 그리고 그들의 프레 젠 테이 션 항 원에 T 세포 활성화 능력을 다른. 실험적 종양 모델의 대부분 예방 접종 필요 DC의 수백만, 그들은 널리 골 수 나 비장 으로부터 격리 됩니다. 그러나, 이러한 DC 크게 다 혈액과 종양 DC에 그들의 응답에서 면역성이 있는 복합물 (IC), 그리고 아마도 다른 lectin Syk 결합 수용 체. 중요 한 것은, 위험 관련 분자에 DC의 감도 감안할 때, 독 또는 crosslink 활성화 수용 체는 격리 중 하나는 항 체의 존재 수 DC의 못쓰게 되며 따라서 매개 변수를 영향을 하거나 적어도 복용량, 그들을 활성화 하는 데 필요한 따라서, 여기 우리가 그들의 조기 활성화를 피하고 있는 동안 혈액과 종양에서 MoDC를 고립 시키기를 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 프로토콜 종양 IC와 함께 MoDC 활성화 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

Introduction

그들의 발견부터 수지상 세포 (DC) T 세포 감 별 법¹왜곡 그들의 독특한 능력으로 인해 광범위 한 연구의 초점을 했습니다. 지난 몇 년간 광범위 한 연구 노력 종양 진행과 면역 ²동안 다양 한 DC 하위 집합 및 그들의 기능을 정의 하기 위해 노력해왔다. Dc는 그들의 패턴 인식 수용 체, 조직 배포에서에서 서로 다른 이기종 세포 인구 구성 및 철새와 항 원 프레 젠 테이 션 기능^3,,45. 다른 DC 하위 집합에 비해 monocyte 파생 된 DC (MoDC) 종양에 훨씬 더 풍부 하 고 순환에서 쉽게 생성 될 수 또는 종양 침투 monocytes^6,7. 따라서, 그들의 상대 보급을 활용 하고자 하는 많은 임상 실험은 T 세포 면역 ^8,9를 유도 하기 위해 헌 MoDC의 비보와 비보 전 조작 기반으로 합니다.

마찬가지로, DC 기반으로 예방 접종 실험 종양 모델의 2-3 직렬 주사, 떨어져, 1-2 10 x 5-7 일 필요⁶ 활성화 된 DC 펄스와 종양 항 원. 따라서, DC의이 많은 수를 달성 하기 위해, 대부분 마우스 연구 주로 사용 MoDC 7-9 일 (IL-4 마우스 설정에 필요 하지 않습니다)에 대 한 GM-CSF에 골 수 (BM) 선구자에서 교양^10,11. 그럼에도 불구 하 고, 주어진 그 GM-CSF 녹아웃 쥐가 전반적으로 정상적인 DC 구획 ^12,의¹³, 그리고 그 문화에서 얻은 혼합된 인구를 주어진¹⁴ 이러한 DC의 생리 적인 관련성 질문으로 불려 왔다.

또는, DC 비장 세포에서 정기적으로 격리 된 수 있습니다. 그러나, DC 구성 약 0.3-0.8% (약 7 × 10⁵ DC/비장 결과), 총 비장 세포의이 세포, CD103만의⁺ DC 및 MoDC 림프 기관에 다시 마이그레이션할 수 있습니다. MoDCs 비장 DC 인구^15,16의 약 10-15%를 구성, 이후 대부분 격리 프로토콜 약 1 × 10⁵ MoDC 비장 당 양보. MoDC의 확장 GM-CSF, 비장 MoDC¹⁷100 증가 결과 분 비 하는 transfected B16 셀을 삽입 하 여 얻을 수 있습니다. 그러나, DC 백신 개발을 위한 MoDC의 사용은 제한 때문에 인간과 취득에이 절차를 수행할 수 없습니다 MoDC 이미 매우 활성화 됩니다.

DC의 적절 한 숫자를 얻는 이외에 헌 암 세포에 대 한 효과적인 DC 백신을 개발 하기 위한 또 다른 도전은 완전히 DC를 활성화 하는 종양에 충분 한 위험 신호의 부족을 포함 한다. Co-stimulatory 신호 유도 패턴 인식 수용 체 (PRR), 또는 c 형 lectin 신호 통로^18,19,,2021의 활성화를 통해 일반적으로 달성 된다. DC를 활성화 하기 위한 더 접근 표면 Fcγ 수용 체 (FcγR)와 상호 작용을 통해 항 원까지 자신의 능력을 악용 합니다. 실제로, 중요 한 원고 수 나타났습니다 예방 설정에서 종양의 성장을 막을 수는 BM 선구자 활성화에서 MoDC의 주입 종양-IgG IC 및 설립된 종양^22,23 의 박멸을 이어질 수 있습니다 .

2 최근 논문, Carmi 외 는 BMDC 및 비장 DC, 달리 고 혈액 종양에서 MoDC에 응답할 수 없습니다 IgG IC 추가 자극 없이 발견 했다. 이 티로신 인산 가수분해 효소 신호^24,25FcγR 통제의 상부 세포내의 존재 때문에 발견 되었다. DC에서 중요 한 검사점을 정의 하 여이 작품 성공 DC 기반 예방 접종에 대 한 요구 사항에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다. FcγR 신호, 그리고 아마도 비슷한 인 산화 폭포를 활용 하 여 다른 lectin 수용 체에서 신호 수 있도록 추가 자극에 대 한 요구 따라서 그들의 고립 동안 DC의 애 벌 칠을 피하에 대 한 필요성을 밑줄.

따라서, 현재 프로토콜 혈액 및 종양, BM, 비장 DC에서 현저 하 게 다르다에서 MoDC의 격리를 설명 하 고 과정에서 고려 가치가 주의 강조.

Protocol

프로토콜 아래 마우스 MoDC의 격리를 참조 하십시오 아직 전반적인 원리 다른 DC 하위 집합 셀에도 적용 될 수 있습니다. 12-16 주 된 C57Bl/6j 생쥐 실험 동물 관리 인증-공인 동물 시설에 대 한 미국 협회에서 유지 되었다. 모든 프로토콜은 스탠포드 대학 및-텔아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 1. 종양의 절연 관련 Monocyte 파생 된 DC 층 류 두건?…

Representative Results

우리는 처음 종양 세포에 바인딩할 순 syngeneic 고 수용자 쥐에서 항 체의 용량 비교. 이 위해, B16F10 LMP 종양 세포 라인 paraformaldehyde에서 고정 되었고 광범위 하 게 씻어. B16F10 흑색 종 세포 선, C57Bl/6 마우스의 폐 전이에서 원래 고립 되었다 이다. LMP는 KrasG12D에서 고립 되었다 췌 장 종양 세포 / +, LSL-Trp53R172H / +, 그리고 Pdx-1-Cre 마우스 129F1 마우스에 꾸준히 성장 하 고. IC를, 종?…

Discussion

마우스에 우 두를 접종에 필요한 DC의 많은 수를 감안할 때 (약 2-4 x 10⁶ DC 한 마우스 당), 예방 접종 BM과 비장 뒤에 그들의 비보 전 활성화에서 DC의 격리를 기반으로하는 생쥐에서 전략의 대부분. 그러나, 종양 DC에서 vivo에서, 비장 및 BM DC 활성화에 대 한 동일한 조건을 사용 하 여 활성화, 자주 하지 효과적인 면역 생산에 성공 하려고 합니다. 두 후속 출판물, Carmi 외. 그 …

Materials

Ficoll-Paque PREMIUM	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	StemCell Technologies	07820
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit	StemCell Technologies	19861
Collagenase IV	Sigma	C9697-50MG	Test each lot for endotoxin
DNase I	Sigma	DN25-10MG
HBSS	ThermoFisher	14025092
FBS	ThermoFisher	16140071	Test each lot for endotoxin
PE-CD11c	Biolegend	117307
APC-CD11b	Biolegend	101211
Brilliant Violet 650 MHCII	Biolegend	107641
AF48- CD86	Biolegend	105017
APC/Cy7-Ly-C6	Biolegend	108423
PE/Cy7-CD15	Biolegend	135523