חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו
Summary
כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.
Abstract
שינוי צורה של גורם גדילה איתות β (TGF-β) מסדיר תפקידים חשובים רבים הדרושים עבור הסלולר הומאוסטזיס, נפוץ overexpressed במחלות רבות, כולל סרטן. TGF-β הוא בחריפות בהפרות גרורות במהלך התקדמות סרטן בשלב מאוחר, הפעלת קבוצת משנה של תאים סרטניים נודדות ופולשני. השיטות הקיימות עבור ניתוח מסלול איתות להתמקד על הקצה של דגמים, אשר לעיתים קרובות מנסים למדוד איתות פוסט-הוק של אירוע ביולוגי, ואינם משקפים את אופי המחלה מתקדמת. . הנה, נדגים מסוים מערכת הכתב הרומן אדנו עבור מסלול איתות TGF-β/Smad3 שיכול לזהות הפעלת גנים ברמת השעתוק בתאים חיים. ניצול של הכתב Ad-CAGA12-Td-טום , ניתן להשיג שיעור זיהום 100% של מד א-MB-231 תאים בתוך 24 שעות בתוך חוץ גופית. השימוש של עיתונאי פלורסנט מאפשר הדמיה של תאים בודדים בשידור חי ב בזמן אמת עם זיהוי ישיר של תאים transcriptionally פעיל. גירוי של תאים נגועים עם TGF-β מציג רק תת-ערכה של תאים transcriptionally פעיל ומעורב תפקודים ביולוגיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת ירידה לפרטים גבוהה ורגישות ברמה תא בודד כדי לשפר את ההבנה של תפקודים ביולוגיים הקשורים TGF-β איתות במבחנה. Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק ניתן גם דיווח ויוו ב בזמן אמת באמצעות היישום של Ad-CAGA12– לוק כתב. לספירה-CAGA12– לוק ניתן למדוד באופן זהה כקווים תא לוציפראז stably transfected המסורתי. יכול להיות מנותח באמצעות הדמיה IVIS המקובלת ונשאר להשגחה חי במהלך התקדמות הגידול, לספק תובנה ייחודית הדינמיקה של מסלול איתות TGF-β Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק של תאים מושתלים ויוו . פרוטוקול שלנו מתאר מערכת משלוח כתב יתרון המאפשר הדמיה תפוקה גבוהה מהירה של תא חי מסלולי איתות גם במבחנה וגם בתוך vivo. בשיטה זו ניתן להרחיב מגוון של התמונה לפי מבחני במתנה בגישה לשחזור והרגיש יסוד ביולוגיה ופיתוח טיפולית.
Introduction
שינוי צורה של גורם גדילה β (TGF-β) הוא ציטוקין חיוני מעורבים בהתפתחות האדם כי אותות דרך heterodimeric קומפלקס המורכב מסוג II ו סוג אני קולטנים1. איגוד לסוג קולטן II תוצאות הגיוס, זרחון של סוג אני קולטן, אשר בתורו phosphorylates במורד הזרם Smad2/3 חלבונים2,3. אלה מופעלות Smad2/3 חלבונים לאגד Smad4, יוצרים קומפלקס translocates לתוך הגרעין ומסדיר שעתוק גנים4. בתנאים homeostatic TGF-β/Smad איתות בחוזקה מוסדר; עם זאת, מחלות רבות, מסלול איתות הוא deregulated, לעיתים קרובות overexpressed המוביל התקדמות של המחלה5,6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תגובת תאי TGF-β heterogenous, subpopulations של תאים פעילים TGF-β/Smad אחראים על תפקוד ביולוגי ב8,באופן תלוי-זמן9. ניתוח הסלולר הנפוצות של TGF-β/Smad איתות כרוך השימוש של מבחני קבוע נקודת הקצה לספק רק תמונה של פעילות תאית, לעיתים קרובות quantitate של אפקט ממוצע TGF-β/Smad10. שיטות אלו, עם זאת, לא במדויק ייצגו ההתנהגויות מולקולרית של TGF-β/Smad איתות במצב פיזיולוגי במהלך התקדמות המחלה. תמונה מבוססי ניתוח של תאים חיים ללכוד את הדינמיקה של הסלולר תהליכים ביולוגיים עם הבנה הן יכולות.
המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה תפוקה גבוהה רגיש של תא חי הדמיה של TGF-β/Smad איתות באמצעות ריאגנטים המבוסס על אדנו. כאן, אנחנו נגועים הקו התא סרטן השד אנושי מד א-MB-231 עם אדנו המבטאת את רצף מחייב מוטיב Smad3 CAGA, לוציפראז (לוק) או Td-עגבניות (Td-טום) מדווח. מערכות כתב adenoviral מספקות שיטה מהירה וזולה מבוא פלסמיד שיכול לגרום שיעור זיהום 100% של שורות תאים סרטן. מערכות כתב adenoviral גם הוחלו בהצלחה על שורות תאים שקשה transfect עם פלסמיד קונבנציונאלי11. ב פרוטוקול זה נתאר תהליך לא פולשנית הדירים להשגת תא חי הדמיה של מסלול איתות TGFβ/Smad הן vivo והן בתוך חוץ גופית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו שיטה כדי לאפשר הדמיה בזמן אמת של TGF-β/Smad3 איתות בתאים חיים יחיד. הרומן בשיטה זו בעבר זיהינו אוכלוסיה המשנה של תאים עם דינמי TGF-β/Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק שהיה משויך הפלישה משופר והעברה8. שיטה זו משפרת על מבחני המסורתי של TGF-β איתות, כגון שהכלים המערבי של זרחון Smad3 ו- TGF-β ממ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) H-JZ. TMBW הוא הנמען של פרס לתארים מתקדמים אוסטרליה מן הממשלה האוסטרלית ו אן הנדרסון הטען את המלגה הבריאות רוטרי אוסטרלי בשותף עם סיבובי של Templestowe, דיין לריפוי.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
