Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak
Summary
Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.
Abstract
Büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştüren hücresel homeostazı için gerekli birçok önemli işlevleri düzenleyen ve yaygın kanser de dahil olmak üzere birçok hastalıklarda overexpressed bulunur. TGF-β şiddetle geç sahne kanseri ilerleme sırasında metastaz göçmen ve invaziv tümör hücre alt grubunu aktive karıştığı. Sinyal yolu analiz için geçerli yöntemleri kez sinyal post-hoc biyolojik olay ölçmek girişimi ve hastalık ilerici doğası yansıtmamaktadır bitiş noktası modellerde odaklanmak. Burada, canlı hücrelerde transkripsiyon harekete geçirmek algılayabilir TGF-β/Smad3 sinyal yolu için belirli bir roman adenovirus muhabir sistemi göstermektedir. Bir Reklam-SIÇ12-Td-Tom muhabir kullanmak, MDA-MB-231 hücre içinde 24 saat içinde in vitrobir % 100 enfeksiyon hızı elde edebilirsiniz. Floresan muhabir canlı tek hücre içinde görüntüleme için kullanılmasına doğrudan kimlik transcriptionally etkin hücre ile gerçek zamanlı. TGF-β ile enfekte hücreleri uyarılması yalnızca bir alt kümesini transcriptionally aktif ve belirli Biyolojik işlevleri dahil olan hücreleri görüntüler. TGF-β sinyal vitroiçin ilgili biyolojik fonksiyonlar anlayışı geliştirmek için yüksek özgüllük ve bir tek hücre düzeyinde duyarlılık için bu yaklaşım sağlar. Transkripsiyon etkinliği de olabilir Smad3 bildirilen in vivo olarak uygulanması yoluyla gerçek zamanlı bir Ad-SIÇ12– Luc muhabir. Reklam-SIÇ12– Luc ve geleneksel stabil transfected luciferase hücre hatları ile aynı şekilde ölçülebilir. İmplante hücreleri içinde vivo Smad3 transkripsiyon faaliyet geleneksel IVIS görüntüleme ile analiz ve canlı tümör ilerleme, TGF-β sinyal yolu dinamikleri içine benzersiz fikir veren sırasında izlenen. Canlı hücre sinyal yolları hızlı yüksek üretilen iş görüntüleme için izin veren bir avantajlı gazeteci dağıtım sistemi bizim protokolünü açıklar vitro ve içinde vivo. Bu yöntem bir dizi görüntü dayalı deneyleri ve temel biyoloji ve terapötik geliştirme için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak hediye için genişletilebilir.
Introduction
Transforming büyüme faktörü β (TGF-β) olduğunu bir heterodimeric tip II oluşan karmaşık sinyaller insan gelişiminde karıştığı bir temel sitokin ve reseptörleri1yazın. Bağlama II reseptör yazın sonuçları işe alım ve fosforilasyon türü ben sırayla aşağı akım Smad2/3 proteinler2,3phosphorylates reseptör. Bunlar Smad4, Smad2/3 proteinler bağlama çekirdeği translocates ve Gen transkripsiyonu4düzenleyen bir kompleksi oluşturan aktif. Homeostatik koşullarda TGF-β/Smad sinyal sıkı bir şekilde düzenlenmiştir; Ancak, birçok hastalığın, sinyal yolu kuralsız ve genellikle ilerleme hastalık5,6,7‘ nin önde gelen overexpressed. Son yıllarda yapılan çalışmalarda altgrupları TGF-β/Smad etkin hücre bir saat-bağımlı bir şekilde8,9biyolojik işlev sorumludur ve TGF-β hücresel yanıt hànzú gösterdi. TGF-β/Smad sinyal yaygın hücresel Analizi hücresel hareketlilik sadece bir görüntüsünü sağlayan ve ortalama TGF-β/Smad etkisi10kez quantitate sabit bitiş noktası deneyleri kullanımını gerektirir. Bu yöntemler, ancak, doğru bir şekilde TGF-β/Smad fizyolojik durumda hastalık ilerlemesi sırasında sinyal moleküler davranışları temsil etmeyebilir. Yansıma tabanlı canlı hücreleri yakalama bir kayma ve zamansal anlayış ile hücresel ve biyolojik süreçlerin dinamiği analizi.
Amacımız TGF-β/Smad adenovirus tabanlı reaktifler kullanarak sinyal canlı hücre görüntüleme için hassas bir yüksek-den geçerek yöntemi geliştirmekti. Burada, bir adenovirus Smad3 SIÇ motifi bağlama sırası ve bir luciferase (Luc) veya Td-domates (Td-Tom) muhabir gen ifade insan meme kanseri hücre satırında MDA-MB-231 bulaşmış. Adenoviral muhabir sistemleri % 100 enfeksiyon oranını kanser hücre hatlarında sonuçlanabilir plazmid giriş için hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar. Adenoviral muhabir sistemleri de başarıyla geleneksel plazmid11ile transfect zor olan hücre hatları için uygulanmış. Bu protokol için tekrarlanabilir ve noninvaziv bir süreç canlı hücre görüntüleme TGFβ/Smad sinyal yolu elde etmek için anlatacağız içinde in vitrove in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz tek canlı hücreler TGF-β/Smad3 sinyal, gerçek zamanlı görüntüleme için izin vermek için bir teknik geliştirdi. Roman bu yöntemi kullanarak, biz daha önce hücre alt nüfus gelişmiş işgali ve geçiş8ile ilişkili dinamik TGF-β/Smad3 transkripsiyon aktivite ile belirledik. Bu yöntem TGF-β, Smad3 fosforilasyon Batı lekesi gibi sinyal için geleneksel deneyleri geliştirir ve TGF-β heterojenite yakalayarak gen ekspresyonu, hedef, TGF-β/Smad3 tümör nüfus içinde sinyal ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) dan gelen hibe için H-JZ tarafından desteklenmiştir. TMBW Avustralya hükümeti bir Avustralya yüksek lisans Ödülü ve Ann Henderson kontör Burs Avustralya Rotary sağlık bir alıcı Templestowe Rotary ve Dine tedavi için ortak olduğunu.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
