Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.
Abstract
Transformación de Factor de crecimiento β (TGF-β) señalización regula muchas funciones importantes para la homeostasis celular y se encuentra comúnmente sobre expresa en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. TGF-β está implicado fuertemente en metástasis durante la progresión del cáncer de etapa tardía, activando un subconjunto de las células del tumor invasivo y migratorias. Los métodos actuales de análisis de la vía de señalización se centran en modelos de punto final, que a menudo tratan de medir señales post-hoc del evento biológico y no reflejan la naturaleza progresiva de la enfermedad. Aquí, demostramos un adenovirus novela reportero sistema específico para la vía de señalización de TGF-β/Smad3 que puede detectar la activación transcripcional en células vivas. Utilizando un reportero Ad-CAGA12-Td-Tom , podemos lograr una tasa de infección del 100% de las células MDA-MB-231 dentro de 24 h in vitro. El uso de un reportero fluorescente permite la proyección de imagen de células vivas en tiempo real con identificación directa de las células transcripcionalmente activas. Estimulación de las células infectadas con TGF-β muestra sólo un subconjunto de las células que son transcripcionalmente activas y participan en funciones biológicas específicas. Este enfoque permite alta especificidad y sensibilidad a un nivel unicelular para mejorar la comprensión de las funciones biológicas relacionadas con TGF-β señalización en vitro. Smad3 actividad transcripcional puede ser también registrados en vivo en tiempo real a través de la aplicación de un Ad-CAGA12– Luc reportero. Ad-CAGA12– Luc puede medirse de la misma manera que las líneas celulares de luciferase estable transfected tradicional. Smad3 actividad transcripcional de las células implantadas en vivo se puede analizar a través de la proyección de imagen convencional de IVIS y seguimiento directo durante la progresión del tumor, proporcionando una visión única en la dinámica de la vía de señalización de TGF-β. Nuestro protocolo describe un sistema reportero ventajosa que permite proyección de imagen de alto rendimiento rápido de vías de señalización de células vivas in vitro e in vivo. Este método puede ser ampliado a una gama de análisis de imagen basado y presenta como un enfoque sensible y reproducible para la biología básica y desarrollo terapéutico.
Introduction
Factor de crecimiento de transformación β (TGF-β) es una citoquina fundamental implicado en el desarrollo humano que las señales a través de un complejo de tipo II heterodiméricos y tipo de receptores1. Unión a receptor II tipo resultados en el reclutamiento y la fosforilación del tipo I del receptor, que a su vez fosforila Smad2/3 aguas abajo proteínas de2,3. Estos activan bind Smad2/3 de proteínas a Smad4, formando un complejo que se transloca en el núcleo y regula la transcripción de gen4. Condiciones homeostáticas de TGF-β/Smad signaling es estrictamente regulado; sin embargo, en muchas enfermedades, la vía de señalización está desregulada y sobreexpresa con frecuencia conducen a la progresión de la enfermedad5,6,7. Estudios recientes han demostrado que la respuesta celular a TGF-β es heterogénea y subpoblaciones de células activadas TGF-β/Smad son responsables de la función biológica en una forma dependiente del tiempo8,9. Análisis celular común de señalización de TGF-β/Smad implica el uso de ensayos de punto final fijo que ofrecen sólo una instantánea de la actividad celular y con frecuencia cuantificar el promedio de efecto de TGF-β/Smad10. Estos métodos, sin embargo, pueden no exactamente representan el comportamiento molecular de señalización de TGF-β/Smad en el estado fisiológico durante la progresión de la enfermedad. Análisis basado en imágenes de células vivas capturar la dinámica de procesos celulares y biológicos con una comprensión espacial y temporal.
Nuestro objetivo fue desarrollar un método sensible de alto rendimiento para obtener imágenes de células vivas de TGF-β/Smad signaling reactivos basados en adenovirus. Aquí, estamos infectados por la línea de celular del cáncer de mama MDA-MB-231 con un adenovirus que expresan la secuencia de enlace de adorno de CAGA de Smad3 y luciferasa (Luc) o gen reportero de Td-tomate (Td-Tom). Adenoviral reportero sistemas proporcionan un método rápido y barato para la introducción de plásmidos que puede resultar en una tasa de infección del 100% en líneas celulares de cáncer. Sistemas de adenoviral reportero también se han aplicado con éxito a líneas celulares difíciles de transfectar con plásmido convencional11. En este protocolo se describe un proceso reproducible y no invasivo para obtener células vivas imágenes de la vía de señalización TGFβ/Smad tanto en vivo como en vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado una técnica para permitir la proyección de imagen en tiempo real de señalización de TGF-β/Smad3 en células vivas individuales. Mediante este novedoso método, previamente hemos identificado una subpoblación de células con actividad transcripcional del TGF-β/Smad3 dinámico que se asoció con mayor invasión y migración8. Este método mejora los análisis tradicionales de señalización de TGF-β, como manchas blancas /negras occidentales de fosforilación del Smad3 y T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a H-JZ. TMBW es un recipiente de un premio de postgrado Australia del gobierno australiano y la beca de Top-Up de Ann Henderson de Australian Health de Rotary en pareja con Rotary de Alicante y Cene una cura.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
