Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

Summary

Nous présentons ici un protocole pour un ex vivo du poumon Cancer du modèle qui imite les étapes de la progression tumorale et contribue à isoler une tumeur primaire, diffuser les cellules tumorales et les lésions métastatiques.

Abstract

Il est difficile d’isoler des cellules tumorales à différents moments de la progression tumorale. Nous avons créé un modèle ex vivo du poumon qui peut montrer l’interaction des cellules tumorales avec une matrice naturelle et un flux continuel d’éléments nutritifs, ainsi qu’un modèle qui montre l’interaction des cellules tumorales avec les composants cellulaires normales et naturelles de la matrice. Le modèle de poumon acellulaire ex vivo est créé en isolant un bloc coeur-poumon de rat et enlever toutes les cellules en utilisant le procédé de DÉCELLULARISATION. La bronche principale droite est liée au large et les cellules tumorales sont placés dans la trachée par une seringue. Les cellules se déplacent et remplir le poumon gauche. Le poumon est ensuite placé dans un bioréacteur où l’artère pulmonaire reçoit un flux continu de médias dans un circuit fermé. La tumeur sur le poumon gauche est la tumeur primitive. Les cellules tumorales qui sont isolées dans les médias circulants sont en circulation les cellules tumorales et les cellules tumorales dans le poumon droit sont des lésions métastatiques. Le modèle de poumon cellulaires ex vivo est créé en sautant le processus DÉCELLULARISATION. Chaque modèle peut être utilisé pour répondre aux questions de recherche différents.

Introduction

Métastases du cancer est le coupable derrière la plupart des décès liés au cancer et pose le défi ultime dans l’effort pour combattre le cancer. L’objectif général de cette méthode est de concevoir un protocole pour une culture de quatre dimensions (4D) cellulaire qui a une dimension de flux, en plus de la croissance tridimensionnelle (3d) cellulaire. Il représente les trois phases du processus de métastase [c’est-à-dire, la tumeur primitive, tumeur cellules circulantes (CTC) et lésions métastatiques].

Durant les trois dernières décennies, les scientifiques du monde entier a donné une richesse inégalée d’informations pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression métastatique dans différents cancers qui ont amélioré la perspective d’une guérison ou de survie sans progression. La prise en charge clinique de certains cancers, comme le cancer, sensiblement améliorée¹; Cependant, certains cancers, tels que le cancer du poumon, ont toujours un faible taux de survie à². Modèles animaux in vitro et in vivo ont grandement contribués à générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent le développement de la maladie. Dans ces dernières années, dérivé de xénogreffes (CDX) de cellules et xénogreffes dérivés de patient (PDX) ont été plus intéressants car ils conservent de nombreuses fonctionnalités pertinentes de tumeur humaine primaire³, telles que la cinétique de croissance, les caractéristiques histologiques, comportementales caractéristiques et la réponse au traitement. Toutefois, chaque modèle a ses limites pour comprendre le mécanisme de formation de la CCT et métastase d’un organes éloignés^4,5,6.

Récemment, nous avons développé un modèle 4D ex vivo pulmonaire du cancer en utilisant le concept de réingénierie d’orgue et culture cellulaire basé sur la perfusion. Elle imite la croissance du cancer du poumon chez l’humain en formant des nodules pleins : tumeurs qui se développent au fil du temps avec un homme similaire du cancer-sécrétée protéine production⁷. Il représente la signature d’expression de gène qui prédit faible taux de survie chez les patients atteints de cancer et montre également une réponse thérapeutique par une régression tumorale sur cisplatine traitement^8,9. Le modèle du poumon a été modifié afin qu’il peut former des lésions métastatiques. La CTC se développent à partir d’une tumeur primaire et intravasate dans le système vasculaire et extravasate dans le poumon controlatéral pour former des lésions métastatiques¹⁰. Études d’expression de gène suggèrent un profil d’expression distincte de la tumeur primitive, la CTC et les lésions métastatiques et la stimulation de l’expression du sous-ensemble de gènes nécessaires pour le phénotype¹⁰. Ce processus métastatique se produit en raison de la présence de conditions biologiques observées chez les patients atteints de cancer. L’avantage de ce modèle est la présence d’une matrice naturelle et l’architecture et une perfusion de nutriments qui conduit à la formation de nodules de la tumeur. En outre, il fournit également l’occasion d’étudier les effets des différentes composantes du microenvironnement tumoral ou de la drogue sur la progression tumorale dans le temps. Ce modèle peut être utilisé pour développer une gamme de cellules cancéreuses (cancer du poumon, cancer du sein, sarcome etc.) dans une mise en place de laboratoire.

Protocol

Les protocoles pour l’expérimentation animale ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche de méthodiste de Houston et d’institutionnels animalier et effectuées conformément à tous les règlements, lois, directives et politiques. 1. récolte de poumon de rat Anesthésier un rat Sprague-Dawley mâle de 4 à 6-semaines par injection intrapéritonéale (IP) de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans son flanc. S’assurer que l?…

Representative Results

Le poumon récolté rat maintient intact système vasculaire et les alvéoles11 (figures 3 a et 3 b). Après DÉCELLULARISATION, les composants de la matrice extracellulaire d’un poumon acellulaire, telles que l’élastine, collagène et la fibronectine sont préserver11 (Figure 3, 3D, 3Eet 3F). La DÉCELLULARISA…

Discussion

Le poumon de 4D ex vivo fournit l’occasion d’étudier la croissance tumorale et les métastases dans une configuration de laboratoire. Une matrice de poumon natif est un système complexe qui offre un soutien aux tissus normaux et maintient les interactions cellule-cellule, interactions cellule-matrice, différenciation cellulaire et organisation tissulaire. Il offre la possibilité d’ajouter des composants de microenvironnement tumoral pour étudier leurs effets sur la croissance tumorale et l’interacti…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula