Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para um ex vivo pulmão câncer modelo que imita as etapas de progressão do tumor e ajuda a isolar um tumor primário, circulam células tumorais e lesões metastáticas.

Abstract

É difícil isolar células tumorais em diferentes pontos da progressão do tumor. Criamos um ex vivo modelo de pulmão que pode mostrar a interação de células tumorais com uma matriz natural e contínuo fluxo de nutrientes, bem como um modelo que mostra a interação de células tumorais com componentes celulares normais e uma matriz natural. O modelo de pulmão acelular ex vivo é criado, isolando um bloco de coração-pulmão de rato e removendo todas as células usando o processo de decellularization. O brônquio principal direito é amarrado e células tumorais são colocadas na traqueia por uma seringa. As células se mover e preenchem o pulmão esquerdo. O pulmão é então colocado em um bioreator onde a artéria pulmonar recebe um fluxo contínuo de mídia em circuito fechado. O tumor crescido no pulmão esquerdo é o tumor primário. As células do tumor que são isoladas nos meios circulantes circulam células tumorais e as células do tumor no pulmão direito são lesões metastáticas. O modelo de pulmão celular ex vivo é criado por ignorar o processo de decellularization. Cada modelo pode ser usado para responder a perguntas de pesquisa diferente.

Introduction

Metástase do cancro é o culpado por trás da maioria das mortes relacionadas ao câncer e representa o desafio final no esforço para combater o câncer. O objetivo geral deste método é desenhar um protocolo para uma cultura de quadridimensional (4D) de celular que tem uma dimensão de fluxo, além do crescimento tridimensional (3D) celular. Ele representa as três fases distintas do processo de metástase [isto é, o tumor primário, circulam células tumorais (CTC) e lesões metastáticas].

Nas últimas três décadas, os cientistas ao redor do mundo gerou uma riqueza incomparável de informações para entender os mecanismos subjacentes a progressão metastática em diferentes tipos de câncer que melhorou a perspectiva de uma cura ou sobrevivência livre de progressão. O manejo clínico de alguns tipos de câncer, como câncer de mama, melhorou significativamente a¹; no entanto, alguns tipos de câncer, como câncer de pulmão, ainda têm uma sobrevivência pobre². Modelos animais in vitro e in vivo têm sido fundamentais para gerar novos insights sobre os mecanismos que sustentam o desenvolvimento da doença. Nos últimos anos, linha-derivado xenografts (CDX) de célula e paciente-derivado xenografts (PDX) tem sido de mais interesse como preservam muitas características relevantes do tumor primário humano³, tais como a cinética de crescimento, características histológicas, comportamentais características e a resposta à terapia. No entanto, cada modelo tem suas limitações para entender o mecanismo de formação do CTC e metástases de um órgão distante^4,5,6.

Recentemente, desenvolvemos um modelo de câncer de pulmão 4-D, ex vivo , utilizando o conceito de reengenharia de órgão e cultura de células com base em perfusão. Ele imita o crescimento do câncer de pulmão humano através da formação de nódulos de tumor perfusable que crescem ao longo do tempo com um semelhante humano câncer-secretada proteína produção⁷. Ele representa a assinatura de expressão do gene que prevê pobre sobrevida em pacientes com câncer e também mostra uma resposta terapêutica pela regressão do tumor com cisplatina tratamento^8,9. O modelo de pulmão mais foi modificado para que ele possa formar lesões metastáticas. O CTC desenvolver a partir de um tumor primário e intravasate na vasculatura e extravasate para o pulmão contralateral para formar lesões metastáticas¹⁰. Estudos de expressão do gene sugerem um perfil de expressão distintas do tumor primário, o CTC e as lesões metastáticas e o upregulation do subconjunto de genes necessários para o fenótipo¹⁰. Este processo metastático ocorre devido à presença de condições biológicas, visto em pacientes com câncer. A vantagem desse modelo é a presença de uma matriz natural e arquitetura e uma perfusão de nutrientes que leva à formação de nódulos de tumor. Além disso, ele também fornece uma oportunidade para estudar os efeitos dos diferentes componentes do microambiente do tumor ou drogas na progressão do tumor ao longo do tempo. Este modelo pode ser usado para crescer um intervalo de células de câncer (câncer de pulmão, câncer de mama, sarcoma, etc.) em uma configuração de laboratório.

Protocol

Protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto de pesquisa de Metodista de Houston e institucional Cuidado Animal e efectuados em conformidade com todos os regulamentos, leis, diretrizes e políticas. 1. colheita de pulmão do rato Anestesia um rato Sprague-Dawley masculino de 4 a 6 semanas de idade por uma injeção intraperitoneal de (IP) da cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em seu flanco. Certifique-se de anestesia, verificando-se…

Representative Results

O pulmão de rato colhido mantém intacta vasculatura e alvéolos11 (Figura 3A e 3B). Sobre decellularization, os componentes de matriz extracelular de um pulmão acelular, tais como a fibronectina, colágeno e elastina, conservam-se11 (Figura 3, 3D, 3Ee 3F). O decellularization leva a uma completa remoção das cé…

Discussion

O pulmão ex vivo 4-D fornece uma oportunidade para estudar o crescimento do tumor e metástases em uma configuração de laboratório. Uma matriz de pulmão nativo é um sistema complexo que oferece suporte ao tecido normal e mantém interações célula-célula, interações célula-matriz, diferenciação celular e organização do tecido. Ele fornece uma oportunidade para adicionar quaisquer componentes de microambiente do tumor para estudar seus efeitos sobre o crescimento do tumor e a interação com outra…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula