Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para un ex vivo lung cáncer modelo que imita los pasos de progresión del tumor y ayuda a aislar un tumor primario, circulación de las células tumorales y las lesiones metastáticas.

Abstract

Es difícil aislar las células tumorales en diferentes puntos de progresión del tumor. Hemos creado un modelo ex vivo lung que puede mostrar la interacción de las células tumorales con la matriz natural y flujo continuo de nutrientes, así como un modelo que muestra la interacción de las células del tumor con componentes celulares normales y una matriz natural. El modelo de pulmón acelular ex vivo es creado por un bloque de corazón y pulmón de la rata de aislar y eliminar todas las células mediante el proceso de descelularización. El bronquio principal derecho se ligan y se colocan las células del tumor en la tráquea por una jeringa. Las células de moverán y llenar el pulmón izquierdo. El pulmón se coloca en un biorreactor donde la arteria pulmonar recibe un flujo continuo de medios de comunicación en circuito cerrado. El tumor en el pulmón izquierdo es el tumor primario. Las células del tumor que se aíslan en los medios de circulación circulan las células tumorales y las células del tumor en el pulmón derecho son lesiones metastásicas. El modelo de pulmón celular ex vivo es creado por saltarse el proceso de descelularización. Cada modelo puede utilizarse para responder a preguntas de investigación.

Introduction

Metástasis del cáncer es el culpable detrás de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer y representa el mayor desafío en los esfuerzos para combatir el cáncer. El objetivo general de este método es diseñar un protocolo para una cultura de cuatro dimensiones (4D) celular que tiene una dimensión de flujo, además del crecimiento de la célula (3D) tridimensional. Representa las tres fases distintas del proceso de metástasis [es decir, el tumor primario, circulación de las células tumorales (CTC) y lesiones metastásicas].

En las últimas tres décadas, los científicos alrededor del mundo rindieron una riqueza sin precedentes de información para entender los mecanismos subyacentes a la progresión metastásica en diferentes tipos de cáncer que mejoró la perspectiva de un cura o una supervivencia libre de progresión. El manejo clínico de algunos tipos de cáncer, como cáncer de mama, mejorado significativamente¹; sin embargo, algunos cánceres, como cáncer de pulmón, aún tienen una supervivencia pobre². Modelos animales in vitro e in vivo han sido fundamentales en la generación de nuevos conocimientos sobre los mecanismos que sustentan el desarrollo de la enfermedad. En los últimos años, derivado de línea xenoinjertos (CDX) de la célula y xenoinjertos derivados del paciente (PDX) han sido de mayor interés como conservan muchas características relevantes del tumor humano primario³, como la cinética de crecimiento, características histológicas, comportamiento características y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, cada modelo tiene sus limitaciones para entender el mecanismo de formación de CTC y metástasis en un órgano distante^4,5,6.

Recientemente, hemos desarrollado un modelo 4-D ex vivo lung Cáncer utilizando el concepto de reingeniería de órgano y de cultivo celular basada en perfusión. Imita el crecimiento de cáncer de pulmón humano mediante la formación de nódulos de tumor perfusable que crecen en el tiempo con un parecido humano secretada cáncer proteína producción⁷. Representa la firma de expresión de gen que predice supervivencia pobre en pacientes con cáncer y también muestra una respuesta terapéutica por regresión del tumor al cisplatino tratamiento^8,9. El modelo de pulmón más fue modificado para que pueda formar las lesiones metastáticas. El CTC se convierten de un tumor primario y intravasate en la vasculatura y extravasate en el pulmón contralateral para formar lesiones metastáticas¹⁰. Estudios de expresión génica sugieren un perfil de expresión distinta del tumor primario, la CTC y las lesiones metastáticas y la regulación al alza del subconjunto de genes para el fenotipo¹⁰. Este proceso metastásico se produce debido a la presencia de condiciones biológicas en pacientes con cáncer. La ventaja de este modelo es la presencia de una matriz natural y arquitectura y una perfusión de nutrientes que conduce a la formación de nódulos del tumor. Además, también proporciona una oportunidad para estudiar los efectos de diversos componentes del microambiente tumoral o medicamentos en la progresión del tumor con el tiempo. Este modelo puede utilizarse para cultivar una variedad de células de cáncer (cáncer de pulmón, cáncer de mama, sarcoma, etc.) en un montaje de laboratorio.

Protocol

Los protocolos para los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en el Instituto Metodista de Houston y llevado a cabo con arreglo a las normas, leyes, directrices y políticas. 1. rata pulmón cosecha Anestesiar una rata Sprague-Dawley macho de 4 a 6 semanas de edad por una inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en su flanco. Asegúrese de que la anestesia comprobando la ausencia de movimiento cua…

Representative Results

El pulmón de rata mantiene el intacto vasculatura y alvéolos11 (Figura 3A y 3B). A descelularización, los componentes de la matriz extracelular de un pulmón acelular, como colágeno, fibronectina y elastina, se conservan11 (figura 3, 3D, 3Ey 3F). La descelularización conduce a un retiro completo de las células…

Discussion

El pulmón ex vivo 4-D proporciona una oportunidad para estudiar el crecimiento del tumor y la metástasis en un montaje de laboratorio. Una matriz de pulmón nativo es un sistema complejo que provee soporte al tejido normal y mantiene interacciones célula-célula, las interacciones célula-matriz, diferenciación celular y la organización de tejido. Proporciona una oportunidad para añadir cualquier componentes del microambiente del tumor para estudiar sus efectos sobre el crecimiento tumoral y la interacció…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula