Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage
Summary
Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.
Abstract
Ces dernières décennies, maladies à transmission vectorielle ont réapparu et a progressé à inquiétante, entraînant une morbidité et mortalité dans le monde entier. Des vaccins efficaces et accessibles font défaut pour la majorité de ces maladies, ce qui a nécessité l’élaboration de stratégies d’atténuation nouvelle maladie. À cette fin, une avenue prometteuse de lutte contre les maladies consiste à cibler le microbiome du vecteur, la communauté de microbes vivant dans le vecteur. Le microbiome vecteur joue un rôle central dans la dynamique de l’agent pathogène, et manipulations de la microbiome ont conduit pour vecteur réduit la transmission pathogène ou d’abondance à une poignée de maladies à transmission vectorielle. Cependant, traduisant ces constatations dans les applications de contrôle de la maladie nécessite une compréhension approfondie de l’écologie microbienne de vecteur, historiquement limité par la technologie insuffisante dans ce domaine. L’avènement des approches de séquençage de nouvelle génération a permis un séquençage rapid et hautement parallèle des diverses communautés microbiennes. Ciblant le gène de l’ARNr 16 s hautement conservée a facilité les caractérisations des microbes présents dans les vecteurs sous diverses conditions expérimentales et écologiques. Cette technique implique l’amplification du gène de l’ARNr 16 s, échantillon barcoding par PCR, échantillons de chargement sur une cellule d’écoulement pour le séquençage, et bioinformatique s’approche pour faire correspondre les données de séquences avec information phylogénétique. Espèces ou identification de genre-niveau pour un grand nombre de répétitions en général peut être atteint que grâce à cette approche, contournant ainsi les défis de détection faible résolution et de la sortie de la culture traditionnelle, microscopie ou coloration histologique techniques. Par conséquent, cette méthode est bien adaptée pour caractériser le vecteur de microbes dans des conditions diverses, mais ne peut actuellement fournir des informations sur la fonction microbienne, l’emplacement au sein du vecteur, ou la réponse au traitement antibiotique. Dans l’ensemble, le séquençage de prochaine génération 16 s est une technique puissante pour mieux comprendre l’identité et le rôle des microbes vecteurs dans la dynamique de la maladie.
Introduction
La résurgence et la propagation de maladies à transmission vectorielle dans les dernières décennies posent une menace sérieuse pour la santé humaine et de la faune mondiale. Des vaccins efficaces font défaut pour la majorité de ces maladies, et contrôle efforts sont entravés par la complexité biologique des vecteurs et des interactions hôte-vecteur. Comprendre le rôle des interactions microbiennes dans un vecteur de transmission d’agents pathogènes peut prévoir l’élaboration de stratégies novatrices qui contourner ces difficultés. En particulier, les interactions entre associés à vecteur microbienne commensaux, symbiotes et les agents pathogènes, dénommés le microbiome, peuvent avoir des conséquences importantes pour la transmission d’agents pathogènes. Des preuves accablantes maintenant prend en charge cette affirmation, avec des exemples démontrant un lien entre le vecteur microbiome et la compétence pour des maladies comme le paludisme, le virus Zika et maladie de Lyme1,2,3. Cependant, traduisant ces constatations dans les stratégies de contrôle des maladies exige une compréhension beaucoup plus détaillée de la structure, fonction et l’origine du vecteur microbiomes. Identification et caractérisation de la communauté microbienne de vecteur sous diverses conditions expérimentales et écologiques constituent une voie importante vers l’avant dans ce domaine.
Une procédure d’identification des résidents microbiennes d’un vecteur pathogène est fournie ici en utilisant la Western Mouette tique, Ixodes pacificus, une espèce de vecteur de l’agent pathogène de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. Alors que les tiques hébergent plus de types de pathogènes humains que n’importe quel autre arthropode, relativement on connaît l’écologie Biologie et de la communauté des tiques microbiomes4. Il est évident que les tiques abritent une grande diversité des virus, bactéries, champignons et protozoaires incluent des commensaux, endosymbiontes et résidents microbienne transitoire5,4. Travail préalable a démontré de fortes variations dans les microbiomes Ixodes associées à la géographie, espèce, sexe, stade de vie et la farine de sang source6,7,8. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces variations restent inconnues et garantissent plus d’enquêtes sur l’origine et l’assemblage de ces communautés microbiennes. Les tiques peuvent acquérir des microbes grâce à une transmission verticale, contact avec les hôtes et l’absorption de l’environnement par les stigmates et bouche pore anal9. Compréhension des facteurs façonner la formation initiale et le développement de la tique microbiome, plus précisément la contribution relative de la transmission verticale et environnementale, est importante pour comprendre les modèles naturels et les variations en tique microbiome diversité et comment ces communautés interagissent au cours de la transmission d’agents pathogènes, avec des applications possibles pour contrôler la maladie ou un vecteur.
Puissantes techniques moléculaires, comme le séquençage de nouvelle génération, maintenant existent pour identifier les communautés microbiennes et peuvent être utilisés pour caractériser le vecteur microbiomes sous diverses conditions environnementales ou expérimentales. Avant l’avènement de ces approches de séquençage haut débit, l’identification des microbes s’est appuyé principalement sur la microscopie et la culture. Alors que la microscopie est une technique rapide et facile, les méthodes morphologiques pour identifier les microbes sont intrinsèquement subjectif et grossier et limitée par la faible sensibilité et détection10. Méthodes axées sur la culture sont largement utilisés pour l’identification microbienne et peuvent être utilisés pour déterminer la susceptibilité des microbes aux traitements de drogue11. Toutefois, cette méthode souffre également d’une sensibilité faible, car on estime que moins de 2 % des microbes environnementales peuvent être cultivées en laboratoire réglé à12. Méthodes de coloration histologiques ont été également employés pour détecter et localiser des microbes spécifiques au sein de vecteurs, activer les enquêtes sur les différentes distributions de taxons au sein de la tique et étudier les hypothèses sur les interactions microbiennes. Cependant, il faut une connaissance préalable de l’identité microbienne pour sélectionner les taches appropriées, rendant cette approche inadaptée pour l’identification et la caractérisation microbienne. En outre, la coloration histologique est un processus laborieux très gourmandes en temps et ne s’adapte pas bien pour les grands échantillons. Approches moléculaires traditionnels tels que Sanger séquençage sont limités de la même façon dans la détection de diverses communautés microbiennes et leur sensibilité.
Séquençage de nouvelle génération permet l’identification rapide des microbes d’un grand nombre d’échantillons. La présence de gènes marqueurs standard et permet davantage de bases de données référence meilleure résolution taxonomique, souvent au niveau du genre ou espèce. Petite sous-unité ribosomal RNA sont fréquemment utilisés pour atteindre cet objectif, avec 16 s rRNA étant le plus commun en raison de la présence de régions conservées et variables à l’intérieur du gène, permettant la création d’amorces universelles avec des amplicons uniques pour chaque bactérien espèces de13,14. Ce rapport décrit en détail une procédure d’identification des taxons dans le microbiome tique par séquençage de nouvelle génération l’ARNr 16 s. En particulier, ce protocole met l’accent sur les étapes de préparation d’échantillons pour le séquençage. Plus généralisée des détails sur le séquençage et bioinformatique étapes vous sont présentés, qu’il y a une variété de plateformes de séquençage et de programmes d’analyse actuellement disponibles, chacun avec une abondante documentation existante. La faisabilité globale de cette approche nouvelle génération séquençage est démontrée en l’appliquant à une enquête de l’Assemblée de la communauté microbienne dans un vecteur clé de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nouvelle génération séquençage des ARNr 16 s est devenu une approche normalisée pour identification microbienne et a permis l’étude d’incidence vecteur microbiomes et de transmission d’agents pathogènes. Le protocole décrit ici en détail l’utilisation de cette méthode pour étudier l’Assemblée de la communauté microbienne dans I. pacificus, une espèce de vecteur de la maladie de Lyme ; Toutefois, il peut facilement être appliqué à l’étude des autres espèces de tiques ou arthropode …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par National Science Foundation accorde à A.S. (# DEB 1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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