Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.
Abstract
Nas últimas décadas, as doenças transmitidas por vetores têm ressurgiu e expandiu-se em alarmantes taxas, causando considerável morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eficazes e amplamente disponíveis vacinas estão faltando para a maioria destas doenças, necessitando o desenvolvimento de estratégias de mitigação da doença romance. Para este efeito, uma avenida promissora de controle da doença envolve alvejar o vetor microbiome, a comunidade de micróbios que habitam o vetor. O vetor microbiome desempenha um papel fundamental na dinâmica do patógeno, e manipulações da microbiome conduziram a vector reduzida abundância ou patógeno de transmissão por um punhado de doenças transmitidas por vetores. No entanto, traduzir esses achados em aplicações de controle da doença requer uma compreensão completa da ecologia microbiana do vetor, historicamente limitada pela tecnologia insuficiente neste campo. O advento da próxima geração de sequenciamento abordagens permitiu arranjar em sequência rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Direcionamento do gene de rRNA 16S altamente conservada tem facilitado caracterizações de micróbios presentes dentro vetores sob diferentes condições ecológicas e experimentais. Esta técnica envolve a amplificação do gene 16S rRNA, barcoding amostra através do PCR, amostras de carregamento para uma célula de fluxo para sequenciamento, e se aproxima de Bioinformática para combinar dados de sequência com informação filogenética. Espécie ou identificação de gênero-nível para um elevado número de repetições normalmente pode ser alcançada através desta abordagem, evadir-se, assim, desafios de baixa detecção, resolução e saída de cultivo tradicional, microscopia ou coloração histológica técnicas. Portanto, esse método é well-suited para caracterizar o vector micróbios sob diversas condições, mas atualmente não pode fornecer informações sobre função microbiana, localização dentro do vetor, ou a resposta ao tratamento com antibióticos. Em geral, 16S sequenciamento de próxima geração é uma técnica poderosa para compreender melhor a identidade e o papel dos micróbios vetor na dinâmica da doença.
Introduction
O ressurgimento e a propagação de doenças transmitidas por vetores nas últimas décadas representam uma séria ameaça para a saúde global de humanos e animais selvagens. Vacinas eficazes estão faltando para a maioria dessas doenças, e os esforços de controle são prejudicados pela natureza biológica complexa de vetores e interações vetor-hospedeiro. Compreender o papel das interações microbianas dentro de um vetor na transmissão do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias que contornar estes desafios. Em particular, as interações entre os comensais microbianas associada a vector, simbiontes e patógenos, referidos como o microbiome, podem ter consequências importantes para a transmissão de agentes patogénicos. Evidência esmagadora agora oferece suporte a essa afirmação, com exemplos que demonstram uma ligação entre o vetor microbiome e competência para doenças como malária, vírus Zika e doença de Lyme1,2,3. No entanto, traduzir esses resultados em estratégias de controle de doenças requer uma compreensão mais detalhada da estrutura, função e origem do vetor microbiomes. Identificação e caracterização da comunidade microbiana vetor sob diferentes condições ecológicas e experimentais constituem um caminho importante para a frente neste campo.
Um procedimento para identificar os moradores microbianos de um vetor do patógeno é fornecido aqui, utilizando o Western nigripes carrapato, Ixodes pacificus, uma espécie de vetor do patógeno doença de Lyme Borrelia burgdorferi. Enquanto carrapatos abrigam mais tipos de patógenos humanos do que qualquer outros artrópodes, relativamente pouco é conhecido sobre a ecologia biologia e comunidade de carrapato microbiomes4. É evidente que os carrapatos abrigam um diversificado leque de vírus, bactérias, fungos e protozoários, que incluem comensais e endossimbiontes residentes microbiana transitória5,4. Trabalho prévio demonstrou fortes variações em Ixodes microbiomes associado com geografia, espécie, sexo, fase de vida e refeição de sangue fonte6,7,8. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta variação permanecem desconhecidos e garantem que mais detalhadas investigações sobre a origem e o conjunto destas comunidades microbianas. Carrapatos podem adquirir micróbios através de transmissão vertical, contato com hosts e captação do ambiente através de espiráculos, boca e anal poro9. Compreender os fatores moldar a formação inicial e desenvolvimento de microbiome o carrapato, especificamente a contribuição relativa da transmissão vertical e ambiental, é importante para compreender os padrões naturais e variações na escala Microbiome diversidade e como essas comunidades interagem durante a transmissão do patógeno, com possíveis aplicações para controle de doença ou vetor.
Poderosas técnicas moleculares, tais como sequenciamento de próxima geração, agora existem para identificar comunidades microbianas e podem ser empregadas para caracterizar o vector microbiomes sob diversas condições ambientais ou experimentais. Antes do advento dessas abordagens de sequenciamento de alta produtividade, a identificação de micróbios baseou-se predominantemente na microscopia e cultura. Enquanto microscopia é uma técnica rápida e fácil, métodos morfológicos para a identificação de micróbios são inerentemente subjetivos e grosseiros e limitada pela baixa sensibilidade e deteção10. Métodos baseados em cultura são amplamente utilizados para identificação microbiana e podem ser usados para determinar a susceptibilidade de micróbios para tratamentos de drogas11. No entanto, esse método também sofre de baixa sensibilidade, como estima-se que menos de 2% dos micróbios ambientais podem ser cultivadas em um laboratório de configuração12. Abordagens de coloração histológicas também foi empregadas para detectar e localizar os micróbios específicos dentro de vetores, permitir investigações de várias distribuições de táxons dentro o carrapato e estudar hipóteses sobre as interações microbianas. No entanto, o conhecimento prévio da identidade microbiana é necessário para selecionando as manchas adequadas, fazendo com que esta abordagem inadequados para a identificação e caracterização microbiana. Além disso, a coloração histológica é um processo altamente demorada e trabalhoso e não se adapta bem para tamanhos de amostra grande. Abordagens moleculares tradicionais tais como Sanger sequenciamento da mesma forma são limitados em sua sensibilidade e a detecção de diversas comunidades microbianas.
Sequenciamento de última geração permite a identificação rápida de micróbios de um grande número de amostras. A presença de genes marcadores padrão e permite que mais de bancos de dados de referência avançada resolução taxonômica, frequentemente ao nível de gênero ou espécie. Pequena subunidade ribossomal RNAs são frequentemente usados para atingir esse objetivo, com 16S rRNA sendo os mais comuns devido à presença de regiões conservadas e variáveis dentro do gene, permitindo a criação de primers universais com amplicons exclusivo para cada bacteriana espécie de13,14. Este relatório detalha um procedimento para identificar táxons no carrapato microbiome através do sequenciamento de próxima geração do 16S rRNA. Em particular, este protocolo enfatiza as etapas envolvidas na preparação de amostras para sequenciamento. Mais generalizada de detalhes sobre o sequenciamento e bioinformática passos são fornecidos, como há uma variedade de plataformas de sequenciamento e análise programas atualmente disponíveis, cada um com extensa documentação existente. A viabilidade global desta abordagem de sequenciamento de nova geração é demonstrada por aplicá-lo a uma investigação do conjunto da comunidade microbiana dentro de um vetor de doença chave.
Protocol
Representative Results
Discussion
Próxima geração sequenciamento de 16S rRNA tem tornar-se uma abordagem padrão para identificação microbiana e permitiu o estudo de como vetor microbiomes afetar a transmissão do patógeno. O protocolo descrito aqui detalha o uso desse método para investigar o conjunto da comunidade microbiana em I. pacificus, uma espécie de vetor para a doença de Lyme; no entanto, pode facilmente ser aplicado para estudar outras espécies de carrapato ou espécies de artrópodes vetores.
Com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concede a A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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