Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama
Summary
Burada bir nesil sıralama iletişim kuralı kimliği ve mikrobiyal topluluklar vektörel çizimler içinde karakterizasyonu sağlayan 16S rRNA sıralama için mevcut. Bu yöntem, DNA ekstraksiyon, amplifikasyon ve barkodlama filogenetik bilgi için sıra verileri eşleştirmek için bir akış-hücre ve Biyoinformatik üzerinde sıralama PCR aracılığıyla örnekleri içerir.
Abstract
Son yıllarda, vektör kaynaklı hastalıklar yeniden ortaya çıktı ve fiyatlar, önemli morbidite ve mortalite dünya çapında neden endişe verici genişletilmiş. Etkili ve yaygın olarak kullanılan aşılar roman hastalığı azaltma stratejileri geliştirme gerektiren bir çoğunluğu bu hastalıklar için eksik vardır. Bu amaçla, hastalık kontrol umut verici bir cadde vektör microbiome, topluluk vektör yaşayan mikroplar hedef belirleme içerir. Vektör microbiome patojen dinamiklerini çok önemli bir rol oynar ve microbiome işlemler indirimli vektör vektör kaynaklı hastalıklar bir avuç bereket veya patojen iletiminde yol açmıştır. Ancak bu bulgular hastalık kontrol uygulamaları içine çeviri vektör mikrobiyal ekoloji, tarihsel olarak bu alanda yetersiz teknoloji tarafından sınırlı kapsamlı bir anlayış gerektirir. Yeni nesil sıralama yaklaşımlar gelişiyle hızlı, son derece paralel sıralama çeşitli mikrobiyal toplulukların sağlamıştır. Son derece korunmuş 16S rRNA gen hedefleme karakterizasyonu mikroplar ekolojik ve deneysel koşullar değişen altında vektörel çizimler içinde mevcut kolaylaştırdı. Bu tekniği 16S rRNA gen, PCR, sıralama için bir akış hücre üzerine yükleme örnekleri ile örnek barkodlama amplifikasyon içerir ve filogenetik bilgileriyle sıra verileri eşleştirmek için Biyoinformatik yaklaşımlar. Türler veya çoğaltır yüksek bir dizi için cins düzeyi kimlik genellikle böylece alçak hafiye, çözünürlük ve çıkış geleneksel kültür, mikroskopi veya histolojik boyama engellemeyi bu yaklaşım yoluyla elde edilebilir teknikleri. Bu nedenle, bu yöntem vektör mikroplar çeşitli koşullar altında karakterize için uygundur ancak bilgileri şu anda sağlayamaz mikrobiyal işlevi, konumu vektör veya antibiyotik tedavisine yanıt içinde tarih. Genel olarak, 16S yeni nesil sıralama kimlik ve vektör mikroplar hastalık dinamikleri rolünü daha iyi anlamak için güçlü bir tekniktir.
Introduction
Diriliş ve vektör kaynaklı hastalıkların yayılması olarak son yıllarda küresel insan ve yabani hayvanlar ve bitkiler sağlık için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Etkili aşılar bu hastalıkların bir çoğu için eksik olan ve denetim çabaları vektörel çizimler ve vektör-host etkileşimleri karmaşık biyolojik doğası tarafından engellemiştir. Mikrobiyal etkileşim bir vektör patojen iletim içindeki rolünün anlaşılması için bu zorlukları aşmak roman strateji geliştirme izin verebilirsiniz. Özellikle, mikrobiyal commensals vektör ilişkili, simbiont ve patojenler, microbiome anılacaktır arasındaki etkileşimler patojen iletimi için önemli sonuçları olabilir. Şimdi kanıt ezici bu iddianın vektör microbiome ve sıtma, Zika virüs ve Lyme hastalığı1,2,3gibi hastalıklar için yetki arasında bir bağlantı gösteren örnekler ile destekler. Ancak bu bulgular hastalık kontrol stratejileri içine çeviri yapı, fonksiyon ve vektör microbiomes kökeni çok daha detaylı bir anlayış gerektirir. Kimlik ve ekolojik ve deneysel koşullar değişen altında vektör mikrobiyal topluluk karakterizasyonu bu alanda önemli bir yol oluşturur.
Bir patojen vektör mikrobiyal sakinleri tanımlamak için bir yordam burada Batı siyah bacaklı kene, Ixodes pacificus, Lyme hastalığı Borrelia burgdorferipatojen bir vektör tür kullanarak sağlanır. Nispeten az insan patojenleri daha fazla tür herhangi bir diğer eklem bacaklılar daha keneler liman iken, kene microbiomes4biyoloji ve topluluk ekolojisi hakkında bilinir. Bu kenelerin virüs, bakteri, mantar ve commensals, endosymbionts ve geçici mikrobiyal sakinleri5,4dahil protozoa çeşitli bir dizi liman açıktır. Ön çalışma güçlü Ixodes microbiomes coğrafya, türler, seks, hayat sahne ve kan yemek kaynak6,7,8ile ilişkili değişimler göstermiştir. Ancak, bu varyasyon yatan mekanizmaları bilinmeyen kalır ve daha ayrıntılı araştırmalar kökeni ve mikrobiyal bu toplulukların Meclisi garanti. Keneler mikroplar dikey iletim yoluyla elde ana bilgisayarlar ve vızıltısı, ağız ve anal gözenek9ortamından alımı ile ilgili. İlk oluşumu ve kene microbiome gelişimini şekillendirme faktörleri anlama, dikey ve çevresel iletim, özellikle göreli katkısını doğal desenler ve kene değişimleri anlamak için önemli microbiome çeşitlilik ve nasıl hastalık ya da vektör kontrol etmek mümkün uygulamalarla patojen iletim sırasında bu toplulukların etkileşim.
Yeni nesil sıralama gibi güçlü moleküler teknikler şimdi mikrobiyal toplulukları tanımlamak için mevcut ve vektör microbiomes çeşitli çevresel veya deneysel koşullar altında karakterize etmek için istihdam edilebilir. Bu yüksek üretilen iş sıralama yaklaşımlar gelişiyle önce mikroplar tanımlaması ağırlıklı olarak mikroskobu ve kültür üzerine dayanıyordu. Mikroskopi hızlı ve kolay bir tekniktir, mikroplar tanımlamak için morfolojik yöntemleri doğal olarak öznel ve kaba ve düşük duyarlılık ve algılama10tarafından sınırlı iken. Kültür tabanlı yöntemleri mikrobiyal tanımlama için genel olarak kullanılan ve ilaç tedavileri11mikroplar duyarlılık belirlemek için kullanılabilir. Ancak, çevre mikroplar az % 212ayarlama bir laboratuarda kültürlü olduğunu tahmin ediyor gibi bu yöntem aynı zamanda düşük duyarlılık uğrar. Histolojik boyama yaklaşımlar da algılamak ve belirli mikroplar vektörel çizimler içinde Yerelleştir, araştırmalar kene içinde çeşitli takson dağılımları etkinleştirmek ve mikrobiyal etkileşim hakkında hipotezler incelemek için istihdam edilmiştir. Ancak, mikrobiyal kimliğinin ön bilgi hasta uygun mikrobiyal karakterizasyonu ve kimlik için bu yaklaşım yapmak uygun lekeleri seçmek için gereklidir. Ayrıca, histolojik boyama çok zaman yoğun, zahmetli bir süreç ve iyi örneklerin boyutu büyük ölçekli değil. Sıralama aynı şekilde onların duyarlılık ve algılama mikrobiyal çeşitli toplulukların sınırlı Sanger gibi geleneksel moleküler yaklaşımlar.
Çok sayıda örnekleri üzerinden mikroplar hızlı tanımlanması için yeni nesil sıralama sağlar. Standart marker gen ve başvuru veritabanları daha fazla sağlar geliştirilmiş cins veya tür seviyesine kez taksonomik çözünürlük. Küçük alt birimi ribozomal RNA’ların 16S rRNA gen içinde korunmuş ve değişken bölgeler varlığı nedeniyle en yaygın olanıdır her bakteriyel için benzersiz amplicons ile evrensel astar oluşturmak için izin ile bu hedefe ulaşmak için sık sık kullanılır tür13,14. Bu rapor 16S rRNA yeni nesil sıralama ile kene microbiome takson tanımlamak için bir yordam ayrıntıları. Özellikle, bu protokolü örnekleri sıralama için hazırlanmasında ilgili adımlar vurgular. Daha tafsilât üstünde nasıl yapılacağını yaygın ve Biyoinformatik adımlar sağlanmaktadır, şu anda mevcut, çeşitli sıralama platformları ve analiz programları gibi her biri ayrıntılı varolan belgeleri. Bu yeni nesil sıralama yaklaşımın genel fizibilite soruşturma mikrobiyal topluluk derleme içinde bir anahtar hastalık vektör uygulayarak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yeni nesil sıralama 16S rRNA, mikrobiyal tanımlama için standart bir yaklaşım haline ve vektör microbiomes patojen iletim etkilemesi çalışma etkin. Burada özetlenen protokolü, ı. pacificus, Lyme hastalığı için bir vektör tür derlemede mikrobiyal topluluk araştırmak için bu yöntemin kullanılması detayları; Ancak, bu kolayca diğer kene türleri veya vektörel arthropod türlerin çalışma için uygulanabilir.
Nitekim, 16S rRNA sıralama microbiome analiz için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından desteklenen Ulusal Bilim Vakfı a.ş. (DEB #1427772, 1745411, 1750037) verir.
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory’s perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria – The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M., Berger, S. L., Kimmel, R. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. 18, 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. . Library Quantification Kit: User Manual. , (2018).
- Genohub. . Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT – how do these taxonomies compare?. BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
