다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

Summary

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

Abstract

최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.

Introduction

부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병^1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.

병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 위한 절차는 여기 서양 검은 다리 진드기, Ixodes pacificus, Lyme 질병 병원 체의 보렐 리아 burgdorferi종의 벡터를 이용 하 여 제공 됩니다. 틱 항구 다른 절지동물 보다 인간 병원 체의 더 많은 종류의, 하는 동안 상대적으로 작은 틱 microbiomes⁴의 생물학과 사회 생태에 대 한 알려져 있다. 그것은 분명 진드기 바이러스, 박테리아, 균 류, protozoans 공생, endosymbionts, 및 과도 미생물 주민^5,4의 다양 한 배열을 항구. 이전 작업 Ixodes microbiomes 지리, 종, 성별, 생활 단계, 및 혈액 식사 소스^6,,78와 관련 된 강력한 변화를 설명 했다. 그러나,이 변화를 기본 메커니즘 알 수와 자세한 출처의 조사와 이러한 미생물 커뮤니티의 보증 합니다. 틱 수직 전송을 통해 미생물을 수집할 수 있습니다 호스트 및 spiracles, 입, 항문 기 공⁹를 통해 환경에서 글귀와 접촉. 초기 형성 및 개발 틱 미생물의 형성 요인 이해, 특히 수직 및 환경 전송의 상대적 기여도 자연 패턴 및 눈금의 변화를 이해 하기 위한 중요 한 미생물 다양성 및 이러한 지역 사회 병원 체 전송, 질병 또는 벡터 제어 가능한 응용 프로그램 중 상호 작용 하는 방법.

차세대 시퀀싱 등 강력한 분자 기법, 지금 식별 미생물 지역 사회에 대 한 존재 하 고 다양 한 환경 또는 실험 조건에서 벡터 microbiomes 하 채택 될 수 있다. 이러한 높은 처리량 시퀀싱 접근의 출현 전에 미생물의 식별 현미경 검사 법 그리고 문화에 주로 의존 했다. 현미경 검사 법은 신속 하 고 쉽게 기술, 미생물을 식별 하기 위한 형태학 메서드는 본질적으로 주관적이 고 굵고 낮은 감도와 감지¹⁰제한. 문화 기반 방법 미생물 식별을 위해 광범위 하 게 사용 하 고 약물 치료¹¹미생물의 감수 성을 결정 하는 데 사용 수 있습니다. 그러나,이 방법은 또한 겪고 있다 낮은 감도에서 환경 미생물의 2% 미만¹²설정 실험실에서 경작 될 수 추정 되었습니다. 조직학 얼룩 접근 감지 하 고 벡터 내에서 특정 미생물을 지역화, 틱, 내 다양 한 taxa 배포판의 조사 활성화 미생물 상호 작용에 대 한 가설을 공부 고용 또한 있다. 그러나, 미생물 정체성의 사전 지식을 적절 한 얼룩, 미생물 특성화 및 식별에 어울리지이 이렇게 만들기를 선택 하는 데 필요 합니다. 또한, 조직학 얼룩 매우 시간이 오래 걸리는, 힘 드는 프로세스 이며 큰 샘플 크기 위해 잘 확장 되지 않습니다. 생어 시퀀싱은 마찬가지로 그들의 감도 다양 한 미생물 커뮤니티의 탐지에서 제한 등 전통적인 분자 접근.

다음-세대 시퀀싱 샘플의 많은 수에서 미생물의 급속 한 식별 수 있습니다. 표준 표식 유전자 및 참조 데이터베이스 추가 하면 종종 단계로 속 또는 종의 분류학 해상도 향상. 작은 소 단위 ribosomal RNAs는 자주 16S rRNA 유전자 보존 및 가변 지역의 존재로 인해 가장 일반적인 각 세균에 대 한 독특한 amplicons 보편적인 뇌관의 창조에 대 한 허용으로이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 종^13,14. 이 보고서는 16S rRNA 차세대 시퀀싱을 통해 틱 미생물에 taxa를 식별 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 시퀀싱에 대 한 샘플 준비 단계를 강조 합니다. 더는 시퀀싱에 대 한 내용을 일반화 및 생물 정보학 단계 제공 됩니다, 현재 사용할 수 있는 다양 한 시퀀싱 플랫폼 및 분석 프로그램으로 각각의 광범위 한 기존 문서. 이 다음-세대 시퀀싱 방법의 전반적인 타당성은 주요 질병 벡터 내 미생물 커뮤니티 어셈블리의 조사에 적용 하 여 설명 했다.

Protocol

1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균 틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m2 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하 개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H2O2), 70% 에탄올 및 ddH2오 5…

Representative Results

총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계?…

Discussion

16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.

실제로, 16S rRNA …

Materials

Item	Name of Material/Equipment	Company	Catalog #
1	DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Magnetic Rack	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20	Teknova	T7724