بالقطع وأسلوب عائم للأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين لتقطيع
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين البارافين تمزيقها. ويجمع هذا الأسلوب قطع والعائمة باستخدام دائرة ترموستاتي بسيطة لتجنب عملية التحويل المطلوبة بالطريقة التقليدية. نتيجة لذلك كانت إلى حد كبير تحسين الكفاءة وعدد المقاطع البارافين سليمة.
Abstract
تقطيع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين يستخدم على نطاق واسع في علم الأنسجة وعلم الأمراض. ومع ذلك، أنها مملة. لتحسين هذا الأسلوب، وضعت العديد من الشركات التجارية أنظمة نقل قسم معقدة باستخدام الماء السائل. لتبسيط هذه التكنولوجيا، أنشأنا طريقة بسيطة باستخدام معدات محلية الصنع الذي يجمع بين قطع والعائمة داخل دائرة ترموستاتي بسيطة؛ ولذلك، أدخل المقاطع تلقائياً حمام الماء على سطح الماء. وقطعت الحصين من العقول الماوس الكبار والكليتين الماوس الكبار وادمغة الفأر الجنينية وعيون الزرد الكبار باستخدام البارافين التقليدية تمزيقها وطريقة عرضها للمقارنة. ويبين التحليل الإحصائي أن لدينا طريقة تحسين حفظ الوقت وإنتاج أعلى جودة المقاطع. وباﻹضافة إلى ذلك، البارافين تقطيع العينة كلها في فترة زمنية قصيرة من السهل لصغار المشغلين.
Introduction
من المهم دراسة الخصائص المورفولوجية في الأبحاث البيولوجية. على الرغم من أن التكنولوجيا الجديدة قد سمح الباحثين مراعاة أهدافها مباشرة من الأنسجة كاملة أو الكائنات الحية1،2،3، قطع العينة إلى أجزاء رقيقة، متبوعاً تلطيخ، تبقى المرحلة الابتدائية الأسلوب فورنوت مورفولوجيا الأنسجة فقط ولكن أيضا البروتين تستهدف مباشرة في الأنسجة. الخفيفة الميكروسكوب يستخدم ثلاثة أنواع المقاطع: البارافين، المجمدة، وسيميثين. على الرغم من أن كريوسيكتيونينج المشتركة لحماية أنتيجينيسيتي الأنسجة، وإعداد نموذج بسيط، مورفولوجيا الأنسجة المحتفظ بها الفقراء وغير مناسب لتقطيع رقيقة4،5. تقطيع البارافين هو الأسلوب الأكثر استخداماً لنستعرض مورفولوجيا حفظت جيدا. كما العينات المجففة تماما وجزءاً لا يتجزأ من الشمع، يمكن تخزين كتل البارافين إلى أجل غير مسمى. وباﻹضافة إلى ذلك، تقطيع البارافين تنتج مقاطع رقيقة تحسين وصول المسبار البيولوجية في مزيد من التجارب، والحد من خلية طبقة تراكب في اتجاه Z.
ومع ذلك، تمزيقها البارافين التقليدية شاقة وتتطلب مهارة المشغل. مقاطع البارافين الخضوع للتثبيت والجفاف، والتضمين، وقطع والعائمة. نقل قسم شرائط من صاحب السكين إلى حمام الماء الأهم من ذلك ضرورية ولكنها صعبة لصغار المشغلين. لا سيما في الهواء الجاف، شرائط القسم سوف تطور بسبب الكهرباء الساكنة ويصعب أن تتكشف على سطح الماء الدافئ. يوصي بتحسين قسم الجودة، يبلل سطح الأنسجة المكشوفة بين مبضع بليد يمر، وتبريد كتل الشمع بغمر لهم في الماء المثلج، أو رفع درجة الرطوبة مع مرطب قرب مبضع6،7 . وتشمل أحدث أساليب لتحسين تمزيقها البارافين التضمين البارافين الهجين، كريوسيكتيونينج8، والقسم التجاري نقل نظام المساعدة9. على الرغم من أن هذه الأساليب تحسين جزئيا البارافين تمزيقها السرعة والجودة، أنها تجعل تمزيقها مرهقة أكثر بكثير، ونظم نقل القسم التجاري غالية الثمن.
في هذا البروتوكول، نحن لشرح كيفية إنشاء معدات بسيطة ورخيصة ومرنة خطوة خطوة، التي يمكن أن تكون مرتبطة إلى صاحب شفرة مبضع الدوارة. وتتألف هذه المعدات قناة قسم وحمام مائي وسخان مع تبديل الكشف عن درجة حرارة. بعد القطع، تتدفق إلى القناة قسم العشرات من الأقسام وأدخل حمام المياه مباشرة، وهكذا تتكشف تلقائياً. وهذا يحسن كفاءة البارافين تمزيقها ويجعل هذه التكنولوجيا أكثر ملاءمة. باستخدام هذا الأسلوب والكبار أكثر أقسام هيبوكامبال الماوس، وأقسام الكلي الماوس الكبار، (E15.5) عمرها يوما 15.5 الجنينية الماوس الدماغ المقاطع والعين الزرد الكبار المقاطع كانت تحصد في وقت أقل وبقيت سليمة أكثر شكلياً. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لعينات الأنسجة الأخرى التي تتطلب البارافين المعجل تمزيقها مع تجنب فقدان التمييز القسم.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحسين البارافين قسم التشكل وإيجاد حل لمشكلة الوقت الضائع أثناء تقطيع البارافين التقليدية، أنشأنا تحسين بارافين تمزيقها الأسلوب الذي يجمع بين القطع وتتكشف. يعتمد هذا الأسلوب محسنة على المعدات البسيطة التي تضم قناة قسم وحمام مائي وسخان مع تبديل الكشف عن درجة حرارة. الشريط قسم يدخل حمام ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (المنحة رقم 31400936، 31460260) و “العلوم الطبيعية مؤسسة جيانغشي مقاطعة من الصين” (20171BAB215020). ونشكر أيضا البرنامج المشترك بين جامعة نانتشانغ، وجامعة الملكة ماري في لندن لدعم هذا العمل.
Materials
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12V 200W) | |||
| Temperature controller(12v 120w) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
