Резка и плавающий метод для парафин врезанных тканей для разрезания
Summary
Здесь мы представляем протокол для улучшения парафин секционирование. Этот метод сочетает в себе резки и плавающие, используя простую термостатический камеру чтобы избежать процесса передачи требуется обычным методом. В результате эффективность и количество нетронутыми парафиновых срезах были значительно улучшены.
Abstract
Секционирование парафин врезанных тканей широко используется в гистологии и патологии. Однако это утомительно. Чтобы улучшить этот метод, несколько коммерческих компаний разработали сложные Секции систем перевода с помощью жидкости воды. Для упрощения этой технологии, мы создали простой метод, с помощью домашнего оборудования, которое сочетает в себе резки и плавающей внутри простой термостатический камеры; Таким образом разделы автоматически ввести ванну водой на поверхности воды. Гиппокамп от взрослых мыши мозги, Взрослый мыши почки, мозги эмбриона мыши и взрослых рыбок данио глаза были сокращены с помощью обычных парафин секционирование и представленный метод для сравнения. Статистический анализ показывает, что наш усовершенствованный метод сэкономить время и выше качество секций. Кроме того парафин секционирование всего образца в короткое время легко для младших операторов.
Introduction
Морфологическое исследование имеет важное значение в биологических исследованиях. Хотя новая технология позволила исследователи соблюдать их целей непосредственно из цельной ткани или организмов1,2,3, резка образца в шлифов, следуют окрашивание, остается основным метод fornot только ткани морфологии, но и белка, ориентации непосредственно в ткани. Световой микроскопии использует три типа раздела: парафин, замороженные и полутонкая. Хотя cryosectioning является общим для защиты ткани антигенностью, и подготовка образца простой, морфология сохранить ткани бедных и непригодна для тонкого резания4,5. Секционирование парафин является наиболее часто используемый метод для экспонирования хорошо сохранившиеся морфологии. Как образцы полностью обезвоженной и встроенных в воск, парафиновые блоки могут храниться бессрочно. Кроме того парафин секущей производит шлифов, которые улучшают доступ к биологическим зонд в дальнейших экспериментов и уменьшить наложения слоя клеток в направлении Z.
Однако обычные парафин секционирование является утомительным и требует навыков оператора. Парафиновых срезах проходят фиксацию, обезвоживание, встраивание, резка и плавающей. Важно отметить, что передача разделе ленты из держателя ножа в водяной бане является необходимым, но трудно для младших операторов. Особенно в сухом воздухе раздел ленты будет твист из-за статического электричества и трудно разворачиваться на поверхности теплой воды. Для улучшения раздела качество, смачивая поверхность подвергается ткани между микротом лезвия проходит, охлаждения блоки воск, погружая их в ледяной воде, или повышение влажности с увлажнитель вблизи микротома рекомендуются6,7 . Новые методы для улучшения парафин секционирование включают внедрение гибридных парафин, cryosectioning8и помощи системы передачи коммерческий отдел9. Хотя эти методы частично улучшить парафин секционирование скорость и качество, они делают секционирование гораздо более громоздкими, и коммерческий отдел передачи системы являются дорогостоящими.
В этом протоколе мы показали, как создать простой, дешевой и гибкой оборудование шаг за шагом, который может быть подключен к держателю лезвия микротом роторный. Это оборудование состоит из секции канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. После резки, десятки разделов впадают в разделе канал и введите ванну водой непосредственно, таким образом разворачивается автоматически. Это повышает эффективность парафина секционирование и делает эту технологию более удобным. Используя этот метод, более взрослой мыши гиппокампа секции, секции почек взрослых мыши, эмбриональных 15.5 дневных (E15.5) мыши мозга секции и взрослых рыбок данио глаз разделы были собраны в меньше времени и более сохранился морфологически. Этот метод может также использоваться для других образцов тканей, которые требуют ускоренного парафин секционирование избегая потери раздела различия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для улучшения парафин раздела морфология и решить проблему потери времени при резании обычных парафин, мы создали более парафин, секционирование метод, который сочетает в себе резки и разворачивается. Этот улучшенный метод основывается на простой оборудования, которое включает разде?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант № 31400936, 31460260) и естественные науки фонд Цзянси провинции из Китая (20171BAB215020). Мы также благодарим совместной программы университета Наньчан и королевы Марии Лондонского университета за поддержку этой работы.
Materials
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12V 200W) | |||
| Temperature controller(12v 120w) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
