Het snijden en drijvende methode voor paraffine-ingebedde weefsel voor het segmenteren
Summary
Hier presenteren we een protocol om paraffine segmenteren. Deze methode combineert snijden en zwevende met behulp van een eenvoudige thermostatische kamer om te voorkomen dat het proces van de overdracht vereist met de conventionele methode. Dientengevolge, waren de efficiëntie en het aantal intact paraffine secties sterk verbeterd.
Abstract
Afdelen van het weefsel van paraffine-ingebedde wordt wijd gebruikt in de histologie en pathologie. Het is echter vervelend. Ter verbetering van deze methode, hebben verschillende commerciële bedrijven bedacht complexe sectie overdracht systemen met behulp van vloeibaar water. Om deze technologie te vereenvoudigen, wij gemaakt een eenvoudige methode om met behulp van zelfgemaakte apparatuur die combineert knippen en drijvende binnen een eenvoudige thermostatische kamer; Daarom voert de secties automatisch het waterbad op het wateroppervlak. De hippocampus van volwassen muis hersenen, volwassen muis nieren, hersenen van muis embryonale en volwassen zebrafish ogen werden gesneden met behulp van zowel conventionele paraffine segmenteren en de onderhavige methode voor vergelijking. Statistische analyse toont aan dat onze verbeterde methode tijd bespaarde en hogere kwaliteit secties geproduceerd. Daarnaast is het gemakkelijk voor junior exploitanten paraffine segmenteren voor een hele specimen in een korte tijd.
Introduction
Morfologische studie is belangrijk in het biologisch onderzoek. Hoewel de nieuwe technologie heeft toegestaan onderzoekers te observeren hun doelstellingen rechtstreeks vanuit het hele weefsel of organismen1,2,3, snijden het specimen in dunne secties, gevolgd door de kleuring, blijft de primaire methode fornot enige weefsel morfologie maar ook eiwit gericht op direct in het weefsel. De lichte microscopie van gebruikt drie typen secties: paraffine, bevroren, en semithin. Hoewel cryosectioning gemeenschappelijk is voor de bescherming van de antigenicity van het weefsel, en de voorbereiding van het monster simpel is, is de morfologie van de ingehouden weefsel slecht en ongeschikt voor dunne vectorafbeeldingsbestanden4,5. Paraffine segmenteren is de meest gebruikte methode voor het tentoonstellen van goed bewaarde morfologie. Zoals de specimens zijn helemaal uitgedroogd en ingebed in de wax, kunnen de paraffineblokken voor onbepaalde tijd worden opgeslagen. Daarnaast produceert paraffine afdelen dunne secties die toegankelijker maken van biologische sonde in verdere experimenten en cel laag overlay in de Z-richting te verminderen.
Conventionele paraffine segmenteren is echter vervelend en exploitant vaardigheid vereist. Paraffine secties ondergaan fixatie, uitdroging, insluiten, snijden en zweven. Bovenal is sectie linten overzetten van de meshouder naar het waterbad noodzakelijk maar moeilijk voor junior exploitanten. Vooral in droge lucht, de sectie linten zal draai als gevolg van statische elektriciteit en zijn moeilijk te ontvouwen op het warme water. Ter verbetering van de afdeling worden kwaliteit, bevochtigen van het oppervlak van de blootgestelde weefsel tussen microtoom blade passeert, koeling van de wax blokken door ze onder te dompelen in ijs water, of het verhogen van de luchtvochtigheid met een luchtbevochtiger in de buurt van de microtoom aanbevolen6,7 . Nieuwere methoden ter verbetering van paraffine afdelen zijn hybride paraffine insluiten, cryosectioning8en commerciële afdeling overdracht systeem bijstand9. Hoewel deze methoden gedeeltelijk paraffine verbeteren afdelen van snelheid en kwaliteit, ze maken afdelen veel omslachtiger, en commerciële sectie overdracht systemen zijn duur.
In dit protocol, we laten zien hoe maak je eenvoudig, goedkoop en flexibel apparatuur stap voor stap, die kan worden aangesloten op de meshouder van rotary microtome. Deze apparatuur bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. Na het uitsnijden, tientallen secties stromen in de sectie kanaal en voer het waterbad rechtstreeks, dus automatisch ontvouwen. Dit verbetert de efficiency van paraffine afdelen en maakt deze technologie geschikter. Met behulp van deze methode, meer volwassen muis hippocampal secties, volwassen muis nier secties, embryonale 15,5 dagen oude (E15.5) muis hersenen secties en volwassen zebrafish oog secties werden geoogst in minder tijd en morfologisch meer intact gebleven. Deze methode kan ook worden gebruikt voor andere weefselsteekproeven waarvoor versnelde paraffine afdelen terwijl het vermijden van verlies van onderscheid van de sectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verbeteren van paraffine sectie morfologie en oplossen van het probleem van tijdverlies tijdens het conventionele paraffine afdelen, we een verbeterde paraffine afdelen methode die snijden en ontplooiing combineert gecreëerd. Deze verbeterde methode is gebaseerd op eenvoudige apparatuur die bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. De sectie lint treedt het waterbad via het kanaal van de sectie en ontvouwt zich automatisch tijdens het snijden. Deze methode v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31400936, 31460260) en de Natural Science Foundation van Jiangxi provincie van China (20171BAB215020). Wij danken ook de gezamenlijk programma tussen Nanchang Universiteit en Queen Mary University of London voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12V 200W) | |||
| Temperature controller(12v 120w) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
