Kesme ve kesit için doku parafin gömülü için yüzen yöntemi
Summary
Burada, parafin kesit geliştirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem kesme ve geleneksel yöntemle gerekli aktarım işlemi önlemek için basit bir termostatik odası kullanarak yüzen birleştirir. Sonuç olarak, verimliliği ve bozulmamış parafin bölüm sayısı büyük ölçüde düzeldi.
Abstract
Parafin gömülü dokusunun kesit Histoloji ve patoloji yaygın olarak kullanılır. Ancak, yorucu olabilir. Bu yöntem geliştirmek için çeşitli ticari şirketler karmaşık bölümüne transfer sistemleri sıvı su kullanarak tasarladılar. Bu teknoloji basitleştirmek için kesme ve basit bir termostatik odası içinde yüzen bir araya getiren ev yapımı donanımları kullanarak basit bir yöntem oluşturdu; Bu nedenle, bölümleri otomatik olarak su yüzeyine su banyosu girin. Hippocampus yetişkin fare beyni, Yetişkin fare böbrekler, embriyonik fare beyni ve yetişkin zebra balığı gözleri kesin karşılaştırma için geleneksel parafin kesit ve sunulan yöntem kullanarak. İstatistiksel analiz bizim geliştirilmiş Yöntem kurtarmak zaman ve yüksek kalite bölümleri üretilen gösterir. Buna ek olarak, kısa bir süre içinde bütün bir örnek parafin kesit junior operatörleri için kolaydır.
Introduction
Morfolojik biyolojik araştırmada önemli bir çalışmadır. Yeni teknoloji hedeflerine doğrudan doğruya–dan tüm doku veya organizmalar1,2,3ince bölüme, numune kesme, boyama tarafından takip gözlemlemek araştırmacılar sağladı rağmen birincil kalır yöntemi fornot tek doku morfoloji aynı zamanda protein dokuda doğrudan hedefleme. Işık mikroskobu üç bölüm türlerini kullanır: Parafin, dondurulmuş ve semithin. Cryosectioning doku antigenicity korumak için ortak ve numune hazırlama basittir, tutulan doku morfoloji yoksul ve ince parça4,5için uygun olsa da. Parafin kesit iyi korunmuş morfoloji sergilenmesi için en sık kullanılan yöntemdir. Numuneler tamamen susuz ve balmumu içinde gömülü olarak, parafin blok süresiz olarak saklanır. Buna ek olarak, parafin kesit biyolojik sonda erişimi daha fazla deneylerde geliştirmek ve hücre katmanı bindirme Z yönünde azaltmak ince kesitler üretir.
Ancak, geleneksel parafin kesit sıkıcı ve Operatör beceri gerektirir. Parafin kesitler fiksasyon, dehidratasyon, gömme, kesme ve yüzen tabi. Önemlisi, Bölüm şeritler bıçaklıklı su banyosu aktarma gerekli ama zor junior operatörleri için. Özellikle kuru hava, Bölüm şeritler statik elektrik nedeniyle kandıracak ve sıcak su yüzeyine açılmak zordur. Bölüm geliştirmek için kalite maruz doku yüzeyi arasında microtome bıçak geçer, onları buzlu suda çeker veya nem microtome yakınındaki bir nemlendirici ile yükselterek mum blok soğutma nemlendirme,6,7 tavsiye edilir . Parafin kesit geliştirmek için yeni yöntemler hibrid parafin katıştırma, cryosectioning8ve ticari bölüm transfer sistemi Yardım9içerir. Her ne kadar bu yöntemler kısmen parafin geliştirmek hız ve kalite, kesit kesit çok daha ağır yapmak ve ticari bölüm aktarma sistemleri pahalıdır.
Bu protokol için bir döner microtome blade sahibine bağlı basit, ucuz ve esnek ekipman adım adım oluşturmak nasıl gösterir. Bu cihaz bir bölüm kanal, bir su banyosu ve bir ısıtıcı bir sıcaklık algılama anahtarı ile oluşur. Kesme sonra bölümleri düzinelerce bölüm kanal akışı ve böylece otomatik olarak elinde tutmasına doğrudan, su banyosu girin. Bu parafin kesit verimliliğini artırır ve bu teknoloji daha uygun hale getirir. Bu yöntem, daha yetişkin fare hipokampal bölümleri, Yetişkin fare böbrek bölümler, embriyonik 15.5 bayat (E15.5) fare beyin bölümleri ve bölümler daha kısa sürede hasat ve morfolojik daha sağlam kaldı yetişkin zebra balığı göz kullanarak. Bu yöntem, Bölüm ayrım kaybı kaçınırken hızlandırılmış parafin kesit gerektiren diğer doku örnekleri için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parafin bölüm morfoloji artırmak ve geleneksel parafin kesit sırasında harcanan zaman sorunu çözmek için biz bir geliştirilmiş parafin kesme ve unfolding birleştirir yöntemi kesit oluşturdu. Bu geliştirilmiş Yöntem bir bölüm kanal, bir su banyosu ve sıcaklık algılama anahtarı ile bir ısıtıcı oluşmaktadır basit ekipman kullanır. Bölüm şerit bölüm kanal üzerinden su banyosu girer ve otomatik olarak kesme sırasında yaşanıyor. Bu nedenle, bu yöntem kalite ve verimlilik, Yetişkin fare …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından (Grant No 31400936, 31460260) destek verdi ve doğal Bilim Vakfı, Jiangxi eyaletinin Çin (20171BAB215020). Biz de Nanchang üniversite ve Queen Mary University of London arasındaki ortak program bu eser destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12V 200W) | |||
| Temperature controller(12v 120w) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
