Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine Luciferase-basierten Biosensor zur Quantifizierung der Kinase-Aktivität von großen Tumorsuppressor (LATS)-einer zentralen Kinase in den Signalweg Hippo. Diese Biosensor hat vielfältige Anwendungen in Grundlagen- und Translationale Forschung zur Hippo Weg Regulierungsbehörden in Vitro und in Vivozu untersuchen.

Abstract

Das Nilpferd Signalweg ist eine konservierte Regulator der Orgel Größe und hat eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Krebs Biologie. Aufgrund der technischen Herausforderungen bleibt es schwierig zu beurteilen, die Aktivität dieser Signalweg und in einem biologischen Kontext zu interpretieren. Die vorhandene Literatur zu großen Tumorsuppressor (LATS) stützt sich auf Methoden, die qualitative und können nicht leicht werden skaliert-Up für das Screening. Vor kurzem, entwickelten wir eine Biolumineszenz-basierten Biosensor um die Kinase-Aktivität des LATS-ein zentraler Bestandteil der Hippo-Kinase-Kaskade zu überwachen. Hier beschreiben wir Verfahren für die Verwendung von diesem Biosensor LATS (LVL-BS) Hippo Weg Regulierungsbehörden zu charakterisieren. Erstens bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der Wirkung eines Protein überexprimieren Kandidaten (z.B.VEGFR2) auf LATS-Aktivität unter Verwendung der LATS-BS. Dann zeigen wir, wie die LATS-BS für einen kleine Kinase-Inhibitor-Bildschirm verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann durchaus realistisch skaliert bis zu größere Bildschirmen, durchführen, die zweifellos neuartige Regulatoren des Hippo-Signalwegs identifiziert werden.

Introduction

Das Nilpferd Signaltechnik Weg zuerst in Drosophila als ein neuartiger Regulator von Zellwachstum und Tiergröße^1,2identifiziert wurde. Seit seiner ersten Entdeckung Montage Beweise hat überzeugend nachgewiesen, dass die Hippo-Weg entscheidende Rolle spielt bei der Entwicklung (z.B.frühe embryonale Entwicklung, Orgel Größe Kontrolle und dreidimensionale [3D] Morphologie), Tumorgenese () z.B., Tumorentstehung, Metastasen, Angiogenese, immun ausweichen, genomische Instabilität, Stressantwort und Resistenzen), und Gewebe Homöostase (z.B., Stammzellen Erneuerung und Differenzierung und Geweberegeneration nach Verletzung) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. Hippo-Signalisierung ist häufig Dysregulated in verschiedenen Krebsarten^{7,8,9,10,11,12}. Daher ist eines der heißesten Gebiete verdeutlichend Funktionen des Hippo-Signalwegs in Krebsbiologie und Therapeutika und regenerative Medizin in der biomedizinischen Forschung geworden.

In Kürze in der Hippo-Pfad, bei Aktivierung durch vorgelagerte Regler (z.B., Zell-Zell-Kontakt, Nährstoff Stress und extrazelluläre Matrix [ECM]), MST1/2 (MST, Säugetier-Homologe von Drosophila Hippo) (S/T)-Serin/Threonin-Kinasen phosphorylieren/aktivieren Adapter Proteine hMOB1 und WW45, sowie LATS1/2 (LATS) Kinasen, die anschließend transkriptionelle Coaktivator YAP und seine Paralog TAZ an konservierten HX(H/R/K)XX(S/T) (H, Histidin phosphorylieren; R, Arginin; K, Lysin; S, Serin; T, Threonin; X, alle Aminosäuren) Motive, darunter YAP-S127 und TAZ-S89^11,12. S127 phosphoryliert YAP (YAP-pS127) und S89 phosphoryliert TAZ (TAZ-pS89) sind durch Ubiquitination abgebaut oder binden an zytoplasmatischen Protein 14-3-3- und werden daran gehindert, Interaktion mit TEAD1-4 Transkriptionsfaktoren im Zellkern zu nachgeschalteten transactivate Gene, die in der Zellproliferation und Apoptose (Abbildung 1). Trotz des enormen Interesses an den Hippo-Weg, existieren nur wenige Instrumente zur Messung der Hippo-Signalisierung und diejenigen, die historisch auf Reporter von YAP/TAZ/TEAD transkriptionelle Ausgabe beschränkt gewesen zu tun. In der Tat, bis vor kurzem gab es keine Instrumente zur Messung der Dynamik und Aktivität der das Nilpferd signalisieren Komponenten in einer quantitativen, in Echtzeit, Hochdurchsatz- und nicht-invasive Weise sowohl in Vitro und in Vivo.

Angesichts unserer aufstrebenden Verständnis der Rolle von Protein-Protein-Interaktionen in Physiologie und Pathologie, gibt es großes Interesse an der Entwicklung der Werkzeuge, die verwendet werden können, um diese Wechselwirkungen in quantitativer und Echtzeit-Art^{13zu studieren, 14,15,16}. In der Tat gab es bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von Bio-analytische Strategien, einschließlich der Hefe zweimischling (Y2H)¹⁷, der Surface Plasmon Resonance (SPR)¹⁸und Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)¹⁹ Assays, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bewerten. Diese Ansätze tragen jedoch die Begrenzung des erforderns signifikante Optimierung der Reporter Orientierung, so dass viele Konstrukte getestet werden müssen, um effizient zu finden. Darüber hinaus haben diese Ansätze auch eine relativ geringe Signal-Rausch-Verhältnis, so dass anspruchsvolle eine wahre positive Signalisierung kann eine Herausforderung sein.

Protein-Ergänzung-Assays wurden entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden. Die erste Generation der Protein-Ergänzung-Assays basierte auf Split multicolor Fluoreszenz Proteine und die vorstehenden Haftungsbeschränkungen²⁰nicht lösen konnte. Multicolor Fluoreszenz Proteine bestehen aus nur einer Domain, macht es schwierig, sie in zwei separaten stabilen Fragmente mit geringer Affinität und Hintergrund Lärm²¹aufgeteilt. Firefly Luciferase wurde anschließend als einen neuen Kandidaten für den Einsatz bei der Entwicklung von Split-Protein-Ergänzung-Assays identifiziert. Bei diesem Ansatz gliedert sich in zwei Fragmente (N-terminale und das C-terminale Luciferase [NLuc und CLuc]) mit jedem Fragment verschmolzen zu einem Zielprotein des Interesses Firefly Luciferase. Wenn die NLuc und CLuc in Nähe auf das Zusammenspiel von zwei Zielproteine gebracht werden, Luciferase-Aktivität wird wiederhergestellt und Biolumineszenz Licht wird im Beisein von Luciferin Substrat und ATP²²erzeugt. Im Jahr 2001 durch Ausführen eine kombinatorische Screening mit einer Bibliothek von NLuc und CLuc Fragmente geschnitten an verschiedenen Standorten und beigefügt sind Proteine mit unterschiedlichen Linker, Paulmurugan und Gambhir an der Stanford University entwickelt eine optimierte Split-firefly Luciferase Komplementierung Fragment-gestützte System für Proteinprotein Interaktionen²³. In diesem System ist Firefly Luciferase Aminosäure (aa) 398 NLuc und CLuc, die an zwei Proteine mit einer flexiblen Linker acht Glycin Rückstände zu bilden und zwei Serin Rückstände schneiden.

Mit einem ähnlichen Ansatz, wir vor kurzem einen neuen LATS-BS durch die Verschmelzung von NLuc bis 15 aa von YAP rund um den LATS Phosphorylierung Ort bei S127 (YAP15) und CLuc mit 14-3-3. Das Full-Length YAP-Protein wurde nicht verwendet, um zu vermeiden, verwirrende Signale von Post-translationalen Modifikationen von YAP (z.B. Phosphorylierung an anderen Standorten und Ubiquitination) von anderen vorgeschalteten Regulatoren. Die hier vorgestellten LATS-BS kann nicht-invasiv Hippo signalisiert Aktivität sowohl in Vitro in lebenden Zellen und in Vivo in Mäusen^20,24 (Abbildung 2) überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung LATS Kinase Aktivität in Vitro mit der LATS-BS. Zunächst zeigen wir, wie LATS-BS verwendet werden kann, um die Wirkung eines überexprimieren Proteins auf LATS Aktivität zu untersuchen. Dann zeigen wir, wie der Biosensor verwendet werden kann, um die Aktivität des Hippo-Signalwegs nach der Behandlung mit Mitteln zur Regelung des Hippo-Weges zu überwachen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, zu identifizieren und zu charakterisieren, Signalisierung Wege oder Reize regulieren LATS-Kinase-Aktivität.

Protocol

1. Untersuchung eines vermeintlichen Regulators der Hippo-Signal mit der LATS-BS Beschichtung und Transfektion von Zellen Vorbereitung der Zellkultur 1 X PBS, DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C in einem Wasserbad für ca. 30 min. warm. Reinigen Sie gründlich einen Biosafety-Schrank mit 70 % Ethanol. Platzieren Sie Gewebekultur Gerichte, Pasteur-Pipetten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen in de…

Representative Results

Der LATS-BS war cotransfected mit verschiedenen Genen, deren Wirkung auf die LATS Aktivität (Abbildung 3) zu bewerten. In diesem Experiment wurde Renilla als interne Kontrolle verwendet. Die transiente Expression von YAP-5SA, ein konstitutiv aktive Form von YAP, Ursachen, die Erhöhung von YAP transkriptionelle Ziele und eine nachträgliche Erhöhung in LATS-Kinase-Aktivität durch einen etablierten Feedback Weg25. MST, die v…

Discussion

Während die Hippo-Signalweg wichtige Rollen in verschiedenen biologischen Prozessen spielt und Dysregulation des Hippo-Signalwegs zu Krebs^{6 führt}, ist wie der Hippo-Weg in Reaktion auf verschiedene Reize reguliert wird nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus gab es keine quantitativen und Echtzeit-System zur Bewertung der Tätigkeit von Hippo Kernkomponenten. Vor kurzem haben wir entwickelt und validiert ein neuartiges Biosensor zur Messung der LATS-Kinase-Aktivität in der Hippo Weg<sup …

Materials

Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer