Monitoraggio di Hippo segnalazione attività di via utilizzando un biosensore di basati su Luciferase grande tumore soppressore (LATS)
Summary
Qui presentiamo un biosensore basato su luciferase per quantificare l’attività della chinasi del soppressore del tumore grande (LATS)-una centrale chinasi della via di segnalazione di Ippona. Questo biosensore ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazionale, volta ad indagare Hippo pathway regolatori in vitro e in vivo.
Abstract
L’ippopotamo via di segnalazione è un regolatore conservato della dimensione dell’organo e ha ruoli importanti nella biologia sviluppo e cancro. A causa di problemi tecnici, resta difficile valutare l’attività di questa via di segnalazione e interpretarla all’interno di un contesto biologico. La letteratura esistente sulla grande oncosoppressore (LATS) si basa su metodi qualitativi e non possono facilmente essere su vasta scala per lo screening. Recentemente, abbiamo sviluppato un biosensore basato su bioluminescenza per monitorare l’attività della chinasi di componente di LATS-a base della cascata della chinasi di ippopotamo. Qui, descriviamo le procedure per come questo biosensore LATS (LATS-BS) può essere utilizzato per caratterizzare i regolatori della via di ippopotamo. In primo luogo, forniamo un protocollo dettagliato per lo studio dell’effetto di un candidato di proteina overexpressed (ad es., VEGFR2) sull’attività LATS utilizzando il LATS-BS. Quindi, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per uno schermo di inibitore di chinasi su piccola scala. Questo protocollo può essere concretamente su vasta scala per eseguire schermi più grandi, che senza dubbio individuerà nuovi regolatori del pathway di ippopotamo.
Introduction
L’ippopotamo signaling pathway è stato identificato in Drosophila come un romanzo regolatore di crescita delle cellule e animali dimensione1,2. Fin dalla sua scoperta iniziale, le prove crescenti ha dimostrato in modo convincente che il pathway di Hippo svolge ruoli critici nello sviluppo (per esempio, lo sviluppo embrionale precoce, controllo delle dimensioni dell’organo e morfologia tridimensionale [3D]), nella tumorigenesi ( ad esempio, lo sviluppo del tumore, metastasi, l’angiogenesi, evasione immune, instabilità genomica, risposta allo stress e resistenza ai farmaci) e dell’omeostasi tissutale (ad es., rinnovamento delle cellule staminali e differenziazione e rigenerazione dei tessuti dopo l’infortunio) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. segnalazione hippo è frequentemente dysregulated in vari cancri7,8,9,10,11,12. Di conseguenza, delucidamento funzioni del pathway ippopotamo nella biologia del cancro e terapeutica e della medicina rigenerativa è diventata una delle aree più calde nella ricerca biomedica.
In breve, nella via dell’ippopotamo, al momento dell’attivazione di regolatori a Monte (ad es., contatto della cellula-cellula, lo stress nutritivo e matrice extracellulare [ECM]), chinasi serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; mammiferi omologhi di Drosophila Ippona) fosforilare/attivare adattatore proteine hMOB1 e WW45, così come chinasi di LATS1/2 (LATS) che, successivamente, fosforilano coattivatore trascrizionale YAP e relativo paralog TAZ a HX(H/R/K)XX(S/T) conservata (H, istidina; R, arginina; K, lisina; S, Serina; T, treonina; X, qualsiasi aminoacidi) motivi, tra cui YAP-S127 e TAZ-S8911,12. S127-fosforilato YAP (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilato (TAZ-pS89) sono degradati da ubiquitinazione o legarsi alla proteina citoplasmatica 14-3-3 e viene impedito che interagiscono con fattori di trascrizione di TEAD1-4 nel nucleo a transactivate a valle geni coinvolti nella proliferazione cellulare e apoptosi (Figura 1). Nonostante l’enorme interesse nella via dell’ippopotamo, esistono alcuni strumenti per la misurazione dell’ippopotamo di segnalazione e quelli che sono stati storicamente limitato ai giornalisti di output trascrizionale YAP/TAZ/TEAD. Infatti, fino a poco tempo fa, non c’erano nessun strumenti per misurare la dinamica e l’attività del Hippo segnalazione componenti in maniera quantitativa, in tempo reale, ad alta velocità e non invasivo sia in vitro che in vivo.
Data la nostra comprensione del ruolo delle interazioni proteina-proteina in fisiologia e patologia emergenti, c’è grande interesse nello sviluppo di strumenti che possono essere utilizzati per lo studio di queste interazioni in una maniera quantitativa e in tempo reale13, 14,15,16. Infatti, c’è stato un progresso significativo nello sviluppo di strategie bioanalitici, inclusi il lievito due-ibrido (Y2H)17, surface plasmon resonance (SPR)18e saggi di Förster risonanza energy transfer (FRET)19 , per valutare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, questi approcci portano la limitazione di che richiedono ottimizzazione significativa dell’orientamento reporter, tale che molti costrutti devono essere testati per trovare uno efficiente. Ulteriormente, questi approcci hanno anche un rapporto segnale-rumore relativamente basso, tale che può essere difficile discernere un vero positivo di segnalazione.
Analisi di complementazione di proteina sono state sviluppate per superare queste limitazioni. La prima generazione di analisi di complementazione di proteina è stata basata sulle proteine di fluorescenza multicolore di Spalato e non riusciva a risolvere le limitazioni di cui sopra20. Fluorescenza multicolore proteine consistono di un solo dominio, rendendo difficile per dividerli in due frammenti separati stabile con bassa affinità e sfondo rumore21. Successivamente, luciferasi firefly è stato identificato come un nuovo candidato per l’utilizzo nello sviluppo di analisi di complementazione di proteina Spalato. In questo approccio, luciferasi firefly sono diviso in due frammenti (N-terminale e C-terminale luciferasi [NLuc e CLuc]) con ogni frammento fusa ad una proteina dell’obiettivo di interesse. Se il NLuc e CLuc sono portati in prossimità sull’interazione delle proteine due bersaglio, l’attività luciferasica è ricostituito e luce bioluminescente viene generata in presenza di substrato luciferina e ATP22. Nel 2001, eseguendo uno screening combinatorio utilizzando una libreria contenente frammenti NLuc e CLuc tagliato in vari siti e associata a proteine con differenti linkers, Paulmurugan e Giacon presso la Stanford University ha sviluppato un ottimizzato Spalato-lucciola sistema di complementazione frammento-assistita di luciferasi per di interazioni proteina-proteina23. In questo sistema, luciferasi firefly viene tagliata due residui di serina e dell’aminoacido (aa) 398 per formare NLuc e CLuc, fissate alle due proteine di interesse utilizzando un linker flessibile di otto residui di glicina.
Utilizzando un approccio simile, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo LATS-BS fondendo NLuc a 15 aa di YAP che circondano il sito di fosforilazione lettoni al S127 (YAP15) e CLuc con 14-3-3. La proteina di YAP full-length non è stata utilizzata, per evitare di confondere i segnali di modificazioni post-traduzionali di YAP (ad es., fosforilazione in altri siti e ubiquitinazione) da altri regolatori a Monte. Il LATS-BS qui presentato non invadente può monitorare Hippo segnalazione attività sia in vitro in cellule viventi e in vivo in topi20,24 (Figura 2). Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la misurazione LATS chinasi attività in vitro utilizzando il LATS-BS. In primo luogo, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per studiare l’effetto di una proteina overexpressed sull’attività lettoni. Quindi, vi mostriamo come biosensore può essere utilizzato per monitorare l’attività del pathway ippopotamo dopo il trattamento con agenti che regolano il pathway di ippopotamo. Questo protocollo potrebbe essere usato per identificare e caratterizzare le vie di segnalazione o stimoli che regolano l’attività della chinasi LATS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la via di Hippo svolge ruoli critici in vari processi biologici e disregolazione del pathway Hippo conduce a cancro6, come il pathway di Hippo è regolamentato in risposta a vari stimoli completamente non è capito. Inoltre, c’ non è stato nessun sistema quantitativo e in tempo reale per valutare l’attività dei componenti di base di ippopotamo. Recentemente, abbiamo sviluppato e validato un biosensore romanzo per misurare l’attività della chinasi lettoni del Hippo pathway<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni dall’Istituto canadese di ricerca salute (CIHR n. 119325, 148629) e la Fondazione canadese per la cancro seno (CBCF) a XY. TA è supportato dalla borsa di studio di laurea Canada Vanier e Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR è supportato da una regina Elizabeth II Graduate Scholarship in scienza e tecnologia.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
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