信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視
Summary
大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin vivoの調査を目的とした基礎やトランスレーショナル研究の多様なアプリケーションがあります。
Abstract
シグナル伝達経路カバは臓器のサイズの節約されたレギュレータし、開発および癌の生物学で重要な役割を持っています。技術的な問題のため、このシグナル伝達経路のアクティビティを評価して、生物学的文脈の中で解釈することは困難残ります。大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) に関する既存の文献は、スクリーニングを質的、ことはできません簡単にするスケール アップ法に依存します。最近では、カバのキナーゼカスケードの背筋のコア コンポーネントのキナーゼ活動を監視する生物発光に基づくバイオ センサーを開発しました。ここでは、我々 はカバ経路レギュレータを特徴付けるためのこの背筋バイオ センサー (LATS BS) の使用方法について手順を説明します。まず、背筋 BS を使用して背筋活動発現タンパク質候補者 (例えばVEGFR2) の効果を調査するための詳しいプロトコルをいたします。その後、小規模なキナーゼ阻害剤スクリーンのための背筋 BS の使用方法を示す.このプロトコルはうまくカバ経路の新規規制当局が確認されます間違いなく大画面を実行するスケール アップをすることができます。
Introduction
カバはシグナリング経路最初ショウジョウバエの細胞の成長と動物サイズ1,2の新規調節因子として同定されました。その最初の発見以来証拠説得力を示しているカバ経路が (例えば、初期胚、臓器サイズ制御、および三次元の [3-D] 形態)、開発に重要な役割を果たしていること腫瘍 (例えば腫瘍の開発、転移、血管新生、免疫回避、ゲノム不安定性、ストレス応答、および薬剤耐性)、および組織恒常性 (例えば、幹細胞の複製分化と損傷後の組織再生)3,4,5,6,7,8,9,10. カバがシグナル伝達は頻繁に様々 な癌7,8,9,10、11,12調節不全。したがって、がん生物学と治療と再生医療でカバ経路の機能を解明となっているホットな分野の生物医学研究における。
一言でいえば、カバ経路、上流のレギュレータ (例えば細胞間接触、養分ストレスは、細胞外マトリックス [ECM]) による活性化に MST1/2 (MST;ショウジョウバエカバの哺乳類ホモログ) セリン/スレオニンキナーゼ (S/T) 活性アダプター蛋白質 hMOB1 と WW45 をリン酸化/アクティブ化だけでなく、その後、転写コアクチベーター ヤップとその相同 (H、ヒスチジン; 保存 HX(H/R/K)XX(S/T) で TAZ をリン酸化するキナーゼを LATS1/2 (ラッツ)R、アルギニン。K, リジン;S、セリン;T, スレオニン;X の任意のアミノ酸) モチーフ、ヤップ S127 TAZ s89 デッドワカサギ11,12を含みます。S127 リン酸化ヤップ (ヤップ-pS127) および s89 デッドワカサギ リン酸化 TAZ (タズ pS89) ユビキチン化によって低下または細胞質タンパク質 14-3-3 にバインドし、下流 transactivate 核 TEAD1 4 転写因子との相互作用を防ぐ細胞の増殖とアポトーシス (図 1) にかかわる遺伝子。カバ経路の途方もない興味、にもかかわらずカバの信号を測定するためのいくつかのツールが存在してヤップ、タズ、TEAD 転写出力の記者に歴史的に限られているか。確かに、ごく最近までなかった定量的、リアルタイム、高スループット、および非侵襲的な方法でコンポーネントをシグナリング カバの状況やダイナミクスを測定するためのツールの in vitroとin vivoの両方。
私たち新興の生理学および病理学のタンパク質間相互作用の役割の理解を与え、定量的かつリアルタイム13、これらの相互作用を研究するためのツールの開発に大きな関心があります。 14,,1516。確かに、進展があった重要な酵母 2 ハイブリッド (Y2H)17、表面プラズモン共鳴 (SPR)18、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)19試金などのバイオ分析戦略の開発蛋白質蛋白質の相互作用を評価します。ただし、その多くの構造は、効率的な 1 つを見つけるテストする必要が、これらのアプローチはレポーター向きの大幅な最適化を必要とする制限を運ぶ。さらに、これらのアプローチもある比較的低い信号対雑音比など真の肯定的な信号を付けに挑戦することができます。
蛋白質否定回路試金は、これらの制限を克服するために開発されました。蛋白質否定回路試金の第一世代は、分割多色蛍光蛋白質に基づいていたし、前述の制限20を解決できなかった。多色蛍光タンパク質は、難しく低親和性とバック グラウンド ノイズ212 つの別々 の安定したフラグメントに分割する 1 つのドメインで構成されます。その後、ホタルのルシフェラーゼはスプリット蛋白質否定回路試金を開発するための新しい候補者として識別されました。このアプローチでは、ホタルのルシフェラーゼは興味のターゲット蛋白質に溶ける各フラグメントと共に 2 つのフラグメント ([NLuc と CLuc] の N 末端と C 末端のルシフェラーゼ) に分割されます。NLuc と CLuc は、2 つのターゲット蛋白質の相互作用の時に近くに持って来られる、ルシフェラーゼ活性を再構成し、ルシフェリン基板と ATP22存在下で発光光を生成します。2001 年を実行して様々 なサイトで NLuc と CLuc フラグメントを含むライブラリを使用して組合せスクリーニングをカット、異なるリンカー蛋白質に付け、Paulmurugan、スタンフォード大学の Gambhir が開発した最適化された分割-ホタル蛋白質蛋白質の相互作用23のルシフェラーゼ フラグメント支援補完システム。このシステムは、ホタルのルシフェラーゼはアミノ酸 (aa) 398 NLuc と CLuc、8 つのグリシン残基の適用範囲が広いリンカーを使用して興味の 2 つの蛋白質に付すを形成する、2 つのセリン残基でカットされます。
我々 は、15 NLuc を融合させることで新しいラッツ BS を最近開発同様のアプローチを使用して、S127 で背筋のリン酸化サイトを取り巻くヤップの aa (YAP15)、14-3-3 で CLuc。他の上流の規制当局がヤップ (例えば、他のサイトでユビキチン化リン酸化) の翻訳後修飾によるシグナルを交絡を避けるためには、実物大のヤップ蛋白質が使用できません。ここで紹介背筋 BS は、両方の細胞の体外および体内マウス20,24 (図 2) で非侵襲的信号活性カバを監視できます。ここでは、ラッツ キナーゼ活動の in vitroラッツ BS を使用して測定のための詳しいプロトコルについて述べる。まず、背筋活性発現タンパク質の効果を調べるための背筋 BS の使用方法を示します。その後、バイオ センサーを使用して、カバの経路を調整するエージェントと治療後カバ経路の活動を監視する方法を示す.このプロトコルは、識別し、シグナル伝達経路やラッツ キナーゼ活動を規制する刺激を分類する使用ことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
カバ経路は様々 な生物学的プロセスに重要な役割を果たしているが、カバ経路の制御不全癌6につながる、様々 な刺激への応答でカバの経路を調整する方法は完全にわかりません。また、カバのコア コンポーネントのアクティビティを評価する定量的およびリアルタイム システムはないずっと。最近、我々 は開発およびカバ経路24ラッツ キナーゼ活性を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品が助成金からカナダの健康研究所 (機構 #119325 148629) によって支えられた、XY にカナダ乳がんがん財団 (CBCF)。TA は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金とオンタリオ州国際大学院奨学金によってサポートされます。HJJVR は、女王エリザベス II 大学院の奨学金科学技術によってサポートされます。
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
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