ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול
Summary
כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.
Abstract
ההיפופוטם איתות הוא מווסת ההכפלה של גודל איבר ויש לו תפקידים חשובים לביולוגיה סרטן ופיתוח. בשל האתגרים הטכניים, זה נשאר קשה להעריך את הפעילות של מסלול איתות זה ומפרשים בתוך הקשר הביולוגי. הספרות הקיימת על מדכאי גדולים (באמת) מסתמך על שיטות הינן איכותיות, לא יכול בקלות להיות קנה המידה להמציא להקרנה. לאחרונה, פיתחנו ביוסנסור מבוססי ביולומינסנציה כדי לפקח על הפעילות קינאז של רכיב מרכזי נצמדתי-a של המפל קינאז היפו. כאן, אנו מתארים את נהלי איך הזה ביוסנסור נצמדתי (השרירים-BS) יכול לשמש כדי לאפיין היפו מסלול הרגולטורים. ראשית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חוקרים את השפעת מועמד חלבונים overexpressed (למשל, VEGFR2) על פעילות השרירים באמצעות השרירים-BS. לאחר מכן, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש עבור מסך מעכבי קינאז בקנה מידה קטן. פרוטוקול זה יתכן כבניין יכול להיות קנה המידה-up כדי לבצע במסכים גדולים יותר, אשר ללא ספק יזהה הרגולטורים הרומן של הנתיב היפו.
Introduction
ההיפופוטם איתות לשביל זוהה לראשונה בדרוזופילה כרגולטור הרומן של צמיחת תאים ושל בעלי חיים בגודל1,2. מאז גילויו הראשונית, הרכבה ראיות בצורה משכנעת הראו כי מסלול היפו משחק תפקידים חיוניים לפיתוח (למשל, התפתחות עוברית מוקדמת, בקרת גודל האיבר, תלת-ממדית [תלת-ממד] מורפולוגיה), tumorigenesis ( למשל, התפתחות גידולים, גרורות, אנגיוגנזה, התחמקות המערכת החיסונית, אי יציבות גנומית, תגובת המתח, עמידות לתרופות), והומאוסטזיס רקמות (למשל, חידוש תאי גזע, בידול, התחדשות רקמות לאחר פציעה) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. היפו איתות לעתים קרובות הוא dysregulated שונים סרטן7,8,9,10,11,12. לכן, שחקרתי פונקציות של מסלול היפו סרטן ביולוגיה ו הרפוי ורפואה רגנרטיבית הפך אחד האזורים החמים ביותר בתחום המחקר הביו-רפואי.
באופן קצר, בשביל היפו, בעת הפעלת ועדות נגד הזרם (למשל, תא-תא מגע, מזין דחק (סטרס) מטריצה חוץ-תאית [ECM]), MST1/2 (MST; homologs בתרבית של היפו דרוזופילה ) סרין/תראונין (S/T) kinases phosphorylate/להפעיל מתאם חלבונים hMOB1 ואת WW45, כמו גם kinases LATS1/2 (באמת), אשר, לאחר מכן, phosphorylate activator תעתיק שיתוף הפה, paralog שלה, טאז-HX(H/R/K)XX(S/T) שנשמרת (H, היסטידין; R, ארגינין; K, ליזין; S, סרין; T, תראונין; X, כל חומצות אמינו) מוטיבים, כולל11,הפה-S127 ו TAZ-S8912. S127 phosphorylated הפה (הפה-pS127), טאז S89-phosphorylated (טאז-pS89) הם נפגמים בשל ubiquitination או לאגד חלבון cytoplasmic 14-3-3, תימנע אינטראקציה עם גורמי שעתוק TEAD1-4 בגרעין כדי transactivate במורד הנהר גנים המעורבים התפשטות תאים, אפופטוזיס (איור 1). למרות האינטרס מסלול היפו עצומה, קיימים כמה כלים למדידת היפו איתות ואלו היו מוגבלים מבחינה היסטורית כתבים של פלט תעתיק הפה/טאז/TEAD. אכן, עד ממש לאחרונה, היו אין כלים למדידת את הדינמיקה ואת הפעילות של ההיפופוטם איתות רכיבים באופן כמותי, בזמן אמת, תפוקה גבוהה, לא פולשנית גם במבחנה וגם בתוך vivo.
בהתחשב שלנו מתעוררים הבנה של התפקיד של אינטראקציות חלבון פיזיולוגיה, פתולוגיה, יש עניין רב בפיתוח של כלים שבהם ניתן להשתמש כדי ללמוד אינטראקציות אלה באופן כמותי, בזמן אמת13, 14,15,16. אכן, חלה התקדמות משמעותית בפיתוח של אסטרטגיות ביו-אנליטית, כולל שמרים 2-היברידית (Y2H)17, משטח פלזמון תהודה (SPR)18ו פורסטר תהודה אנרגיה העברה (סריג)19 מבחני, להערכת אינטראקציות חלבון חלבון. עם זאת, גישות אלה נושאים המגבלה של דרישת אופטימיזציה משמעותית כיוון הכתב, כך מבנים רבים חייבים להיבדק כדי למצוא יעיל. עוד, גישות אלה יש גם יחס אות לרעש נמוכה יחסית, כך אניני טעם איתות חיובי אמיתי עשויה להיות מאתגרת.
חלבון קומפלמנטציה מבחני פותחו כדי להתגבר על מגבלות אלה. הדור הראשון של חלבון קומפלמנטציה מבחני התבססה על פיצול פלורסצנטיות ססגוניות חלבונים, לא יכלו לפתור את המגבלות הנ ל20. קרינה פלואורסצנטית ססגוניות חלבונים מורכבים של תחום אחד בלבד, ולכן קשה לפצל אותם שני קטעים יציב נפרד עם זיקה נמוכה, רעש רקע21. לאחר מכן, גחלילית לוציפראז מזוהה בתור מועמד חדש לשימוש בפיתוח מבחני קומפלמנטציה חלבון פיצול. בגישה זו, גחלילית לוציפראז מחולק שני קטעים (N-מסוף ו- C-מסוף לוציפראז [NLuc, CLuc]) עם כל שבר דבוקה חלבון המטרה של עניין. אם NLuc ואת CLuc מועברים אל תוך הקרבה על האינטראקציה של החלבונים שני היעד, פעילות לוציפראז הוא מחדש, אור זוהרים נוצר בנוכחות סובסטרט luciferin ו- ATP22. בשנת 2001, על ידי ביצוע הקרנה קומבינטורית באמצעות ספריה המכילה שברי NLuc ו- CLuc באתרים שונים גזורה מחוברים חלבונים עם linkers שונים, Paulmurugan ו- Gambhir באוניברסיטת סטנפורד פיתחה של אופטימיזציה של פיצול-גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה פרגמנט בסיוע מערכת עבור אינטראקציות חלבון-חלבון23. במערכת זו, נחתך גחלילית לוציפראז-חומצת אמינו (aa) 398 כדי ליצור NLuc ו CLuc, אשר מחוברים שני חלבונים עניין באמצעות מקשר (linker) גמיש של שמונה שאריות גליצין, שני סרין ומשקעים.
שימוש בגישה דומה, לאחרונה פיתחנו נצמדתי חדשה-תואר BS מאת פיוזינג NLuc ל-15 aa של הפה סביב אתר זרחון נצמדתי-S127 (YAP15), CLuc עם 14-3-3. החלבון הפה באורך מלא היה לא רגיל, כדי למנוע בלבול אותות על ידי שינויים post-translational של הפה (למשל, זרחון על אתרים אחרים, ubiquitination) על ידי הרגולטורים במעלה אחרים. נצמדתי-BS שהוצגו כאן לא-פולשנית לנטר היפו איתות פעילות הן חוץ גופית בתוך תאים חיים והן ויוו עכברים20,24 (איור 2). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט למדידת נצמדתי קינאז הפעילות במבחנה באמצעות השרירים-BS. ראשית, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש כדי לחקור את השפעת חלבונים overexpressed בפעילות השרירים. לאחר מכן, אנו מראים איך החיישן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של השביל היפופוטם לאחר הטיפול עם סוכנים להסדרת מסלול היפו. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין איתות המסלולים או גירויים ויסות פעילות קינאז השרירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ואילו השביל היפו משחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים שונים, ומוביל dysregulation של הנתיב היפו סרטן6, איך מסלול היפו מוסדר בתגובה לגירויים שונים אינה מובנת לחלוטין. בנוסף, חלה לא כמותית ומערכת בזמן אמת כדי להעריך את הפעילות של רכיבי הליבה היפו. לאחרונה, אנחנו פיתח ואומת על ביוסנס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ קנדי המכון לבריאות למחקר (CIHR #119325, 148629), את קנדי השד סרטן הקרן (CBCF) כדי XY. TA נתמך על ידי את המלגה לתואר שני של קנדה וניהר הבינלאומי אונטריו המלגה לתואר שני. HJJVR נתמך על ידי המלכה אליזבת השנייה במלגה ללימודי תואר שני במדע וטכנולוגיה.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
