利用磁性纳米粒子丰富和扩大罕见抗原特异性 t 细胞
Summary
抗原特异性 t 细胞由于其频率极低, 很难在治疗中表征或利用。在此, 我们提供了一个协议, 以开发一个磁性粒子, 它可以结合到抗原特异性 t 细胞, 以丰富这些细胞, 然后扩大他们的几百倍, 用于表征和治疗。
Abstract
我们开发了一种工具, 既能丰富又能扩大抗原特异性 t 细胞。这在 a) 检测抗原特异性 t 细胞的存在等情况下很有帮助, b) 探测抗原特异性反应的动态, c) 了解抗原特异性反应如何影响疾病状态, 如自身免疫性, d) 消除异质性的疾病状态抗原特异性 t 细胞 (e) 的反应利用抗原特异性细胞进行治疗。该工具是基于一个磁性粒子, 我们结合抗原特异性和 t 细胞共刺激信号, 我们将其称为人工抗原呈现细胞 (aAPCs)。因此, 由于该技术生产简单, 可方便地被其他实验室采用;因此, 我们在这里的目的是详细描述的制造和随后的使用的 apc。我们解释了如何将抗原特异性和共刺激信号附加到 aAPCs, 如何利用它们来丰富抗原特异性 t 细胞, 以及如何扩大抗原特异性 t 细胞。此外, 我们将根据我们在抗原特异性 t 细胞特征方面的经验的实验和生物学信息, 重点介绍工程设计方面的考虑。
Introduction
随着许多免疫疗法的兴起, 有必要能够描述和控制免疫反应。特别是, 由于细胞的特异性和耐久性, 适应性免疫反应是有意义的。最近, 嵌合体抗原受体 t 细胞疗法已被批准用于癌症治疗;然而, 抗原受体根据共同的细胞表面抗原 cd19, 而不是抗原特异性的癌症1。除了特异性之外, 免疫疗法还可能缺乏控制, 对癌症或自身免疫功能内的动态免疫反应了解有限。
研究抗原特异性反应的挑战之一是其极低的频率,例如, 抗原特异性 t 细胞是每 10 4 至 106 t 细胞 2,3中的1个。因此, 为了研究哪些 t 细胞存在或响应, 细胞要么需要丰富和扩大, 要么需要放大其信号。使用目前专注于抗原特异性细胞扩张的技术来维护馈线单元是昂贵和困难的。目前的技术, 重点是放大抗原特异性 t 细胞的信号, 如酶联免疫罐 (elispot) 检测, 限制了这些 t 细胞4的再利用。最后, 由于灵敏度较低, 通常需要将这两种技术结合起来才能进行抗原特定的枚举。
为了解决这些问题, 我们开发了基于磁性纳米粒子的人工抗原呈现细胞 (aAPC)5,6,7,8。aAPC 可以功能化与抗原特异性信号肽加载主要组织相容性复合体 (pmhc) 和共同刺激分子-例如, 抗 cd28抗体既丰富抗原特异性 t 细胞, 然后随后刺激它们的扩张 (图 1)。因此, 这些颗粒可以是一种经济高效的现成产品, 既可以定制, 以满足抗原特定的刺激, 但在实验和患者之间实现标准化。执行富集和膨胀过程可使抗原特异性 cd8 + t 细胞膨胀数到千倍, 并可在短短一周内将频率提高到 60%, 从而实现大型 cd8 + t 细胞的表征或治疗使用。细胞的数量。本文介绍了纳米粒子 aAPCs 的制备方法, 在选择纳米粒子性能时的一些关键设计考虑因素, 并展示了利用这些粒子分离和扩展稀有抗原特异性 cd8 + t 细胞的一些典型结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们创造了一种基于纳米粒子人工抗原呈现细胞 (aAPCs) 的抗原特异性 t 细胞分离技术。纳米粒子 aAPCs 表面含有含肽的 mhc, 可在共同刺激激活的同时, 实现抗原特异性 t 细胞的结合和激活。aAPCs 也是顺磁性的, 因此可以利用磁场来丰富罕见的抗原特异性 t 细胞。我们对纳米颗粒的尺寸、配体密度、配体选择及其对结合、富集、活化和细胞富集的影响等关键特性进行了优化和研究 (补充文件 1-box …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
j. w. h. 感谢约翰·霍普金斯生物技术研究所的 nih 癌症纳米技术培训中心、国家科学基金会研究生研究金 (dge-1232825) 和 arcs 研究金支助基金会。这项工作得到了国家卫生研究院 (p01-a072677、r01-ca108835、r21-c185819)、tedco/to01 创新倡议和库尔特基金会 (jps) 的支持。
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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