Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas
Summary
As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.
Abstract
Nós desenvolvemos uma ferramenta para enriquecer e expandir as células T antígeno-específicas. Isto pode ser útil em casos como de A) detectar a existência de pilhas de T antígeno-específicas, B) sondar a dinâmica das respostas antígeno-específicas, C) compreender como antígeno-específicos respostas afetam o estado de doença, tais como a auto-imunidade, D) desmistificar heterogêneos respostas de células T antígeno-específicas, ou E) utilizam células antígeno-específicas para a terapia. A ferramenta baseia-se em uma partícula magnética que nós conjugado antígeno-específicas e sinais co-estimulatória de célula T, e que nós chamamos como apresentadoras artificial de células (aAPCs). Consequentemente, uma vez que a tecnologia é simples de produzir, ele pode facilmente ser adotado por outros laboratórios; assim, nosso objetivo aqui é descrever detalhadamente a fabricação e o uso subsequente da aAPCs. Nós explicamos como anexar antígeno-específicas e co-estimulatória sinais para a aAPCs, como utilizá-los para enriquecer para as células T antígeno-específicas e como expandir as células T antígeno-específicas. Além disso, destacaremos considerações com base em informações experimentais e biológicas de nossa experiência com caracterizando as células T antígeno-específicas de projeto de engenharia.
Introduction
Com a ascensão de muitos imunoterapias, há uma necessidade de ser capaz de caracterizar e controlar respostas imunes. Em particular, a resposta imune adaptativa é de interesse devido a especificidade e a durabilidade das pilhas. Recentemente, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico foram aprovadas para a terapia do câncer; no entanto, os receptores de antígeno são baseados fora comum célula superfície antígeno CD19, em vez dos antígenos específicos para o câncer1. Além da especificidade, imunoterapias também podem sofrer com a falta de controle e limitada a compreensão da resposta imune dinâmica dentro de câncer ou auto-imunidade.
Um dos desafios de estudar respostas antígeno-específicas é sua extremamente baixa frequência, por exemplo., as células T antígeno-específicos são 1 de cada 104 106 T células2,3. Assim, para investigar qual T células estão presentes ou respondendo, as células precisam tanto ser enriquecido e ampliado, ou o sinal deles precisa ser amplificado. É caro e difícil de manter as células de alimentador usando técnicas atuais que incidem sobre a expansão de células antígeno-específicas. Células de técnicas atuais que enfocam amplificando o sinal de T antígeno-específicos, como a enzima-lig immunospot (ELISPOT) do ensaio, limitar a re-utilização dessas células T4. Finalmente, devido à baixa sensibilidade, muitas vezes estas duas técnicas precisam ser combinada para enumeração de antígeno-específicas.
Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos o antígeno de artificiais baseados em nanopartículas magnéticas apresentando célula (aAPC)5,6,7,8. A aAPC pode ser acrescida com um complexo antígeno-específicas-peptídeo sinal carregado histocompatibilidade (pMHC) – e moléculas coestimulatórias –ex., um anticorpo anti-CD28-para ambos enriquecer as células T antígeno-específicas e então posteriormente estimule sua expansão (Figura 1). As partículas, portanto, podem ser um produto de prateleira econômico que pode ser tanto personalizado para atender a estímulos de antígeno-específicas ainda padronizado através de experimentos e pacientes. Realizar o enriquecimento e a expansão processar resultados em centenas de milhares-dobra expansão de células T CD8 + de antígeno-específicas e pode resultar em frequências de até 60% após apenas uma semana, permitindo a caracterização ou uso terapêutico do grande número de células. Aqui, descrevemos como fazer nanopartículas aAPCs, algumas considerações de projeto crítico em escolher as propriedades de nanopartículas e demonstrar alguns resultados típicos de utilizar essas partículas no isolamento e na expansão raras células de CD8 + T antígeno-específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós criamos uma tecnologia de isolamento romance celular de T antígeno-específicos com base em nanopartículas artificial células apresentadoras (aAPCs). Nanopartículas aAPCs peptídeo-carregou MHC na superfície que permite a ligação de pilha de T antígeno-específicas e ativação ao lado de ativação co-estimulatória. aAPCs também são paramagnéticos e assim pode ser usados para enriquecer as células T antígeno-específicas raras usando um campo magnético. Nós temos otimizado e estudou Propriedades de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. obrigado NIH câncer nanotecnologia centro de treinamento no Instituto Johns Hopkins para nanobiotecnologia, a nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa (DGE-1232825) e a Fundação de arcos de apoio à comunhão. Este trabalho foi financiado pelo apoio do National Institutes of Health (R21 de P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de inovação TEDCO/Maryland e a Fundação de Coulter (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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