Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas
Summary
Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.
Abstract
Hemos desarrollado una herramienta para enriquecer y expandir las células T específicas de antígeno. Esto puede ser útil en casos tales como A) detectar la existencia de antígenos específicos de células T, B) sondear la dinámica de las respuestas específicas de antígeno, C) entender cómo respuestas antígeno específicas afectan al estado de enfermedad como autoinmunidad, D) desmitificar heterogéneos las respuestas de células T específicas de antígeno, o E) utilizan células de antígeno-específica para la terapia. La herramienta se basa en una partícula magnética que hemos conjugado antígeno específicas y células T señales coestimuladoras y que llamamos como artificial antígeno que presenta las células (aAPCs). En consecuencia, puesto que la tecnología es fácil de producir, se puede fácilmente ser adoptado por otros laboratorios; por lo tanto, nuestro propósito aquí es describir en detalle la fabricación y el uso posterior de la aAPCs. Se explica cómo asociar señales coestimuladoras y antígeno específicas a la aAPCs, cómo utilizarlas para enriquecer para linfocitos T antígeno específicos y cómo ampliar linfocitos T antígeno específicos. Además, se destacan ingeniería diseño consideraciones basan en información experimental y biológica de nuestra experiencia con caracterización de linfocitos T antígeno específicos.
Introduction
Con el surgimiento de muchos inmunoterapias, hay necesidad de ser capaz de caracterizar y controlar las respuestas inmunitarias. En particular, la respuesta inmune adaptativa es de interés debido a la especificidad y la durabilidad de las células. Recientemente, terapias de la célula de T del receptor de antígeno quimérico se han aprobado para la terapia del cáncer; sin embargo, los receptores de antígeno se basa en el antígeno de superficie celular común CD19, en lugar de los antígenos específicos para el cáncer1. Más allá de la especificidad, las inmunoterapias pueden sufrir de la falta de control y la limitada comprensión de la dinámica respuesta inmune en cáncer y autoinmunidad.
Uno de los desafíos de estudiar la respuesta antígeno específica es su extremadamente baja frecuencia, por ej., linfocitos T antígeno específicos son 1 de cada 104 106 T células2,3. Así, para investigar que T las células están presentes o en respuesta, las células necesitan que sea enriquecido y ampliado, o su señal a amplificar. Es caro y difícil de mantener las células de alimentador mediante las técnicas actuales que se centran en la expansión de las células antígeno específicas. Las técnicas actuales que se centran en amplificar la señal de T específicas de antígeno de las células, como ensayo de la enzima-ligado immunospot (ELISPOT), limitar la reutilización de esas células de T4. Por último, debido a la baja sensibilidad, con frecuencia estas dos técnicas deben combinarse para la enumeración específica de antígeno.
Para enfrentar estos problemas, hemos desarrollado el antígeno artificiales basados en nanopartículas magnéticas que presenta células (aAPC)5,6,7,8. La aAPC puede ser funcionalizado con un complejo de péptido señal específica de antígeno cargado de histocompatibilidad (pMHC) y moléculas coestimuladoras –e.g., un anticuerpo anti-CD28-tanto enriquecer las células T antígeno específica y posteriormente estimular su expansión (figura 1). Las partículas así pueden ser un producto estándar rentable que puede ser tanto modificado para requisitos particulares para cubrir estímulos específicos de antígeno estandarizado a través de experimentos y pacientes. Realizar el enriquecimiento y ampliación del proceso resultados en cientos de miles de doble expansión de antígenos específicos de células CD8 + T y puede resultar en frecuencias hasta un 60% después de sólo una semana, lo que permite la caracterización o uso terapéutico de la gran número de células. Adjunto, describimos cómo hacer nanopartículas aAPCs, algunas consideraciones de diseño críticas en la elección de las propiedades de las nanopartículas y demostrar algunos resultados típicos de utilización de estas partículas en aislamiento y expansión de células T CD8 + específica de antígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos creado una tecnología de aislamiento de novela células de T específicas de antígeno basada en nanopartículas artificiales antígeno que presenta las células (aAPCs). Nanopartícula aAPCs péptido-carga del MHC en la superficie que permite la Unión de células de T específicas de antígeno y activación junto con activación coestimuladoras. aAPCs también son paramagnéticos y así se puede utilizar para enriquecer raros antígenos específicos de células T mediante un campo magnético. Hemos optimizado y …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. agradece el centro de entrenamiento de NIH cáncer nanotecnología en el Instituto de Johns Hopkins la nanobiotecnología, la nacional Science Fundación graduados beca de investigación (DGE-1232825) y la Fundación de arcos para apoyo de becas. Este trabajo fue financiado por el apoyo de los institutos nacionales de salud (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de innovación TEDCO/Maryland y la Fundación de Coulter (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
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