Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц
Summary
Антиген специфические Т-клеток трудно характеризовать или использовать в терапии из-за их крайне низкой частоты. Здесь, мы предоставляем протокол к разработке магнитных частиц, который можно привязать к антиген специфические клетки T обогатить эти клетки и затем, чтобы расширить их несколько стократное характеристика и терапии.
Abstract
Мы разработали инструмент как обогатить и расширять антиген специфические Т-клеток. Это может быть полезно в тех случаях, таких, как A) обнаружить существование антиген специфические Т-клеток, B) зонд динамику антиген специфические реакции, C) понять как антиген специфические реакции влияют на болезненное состояние таких аутоиммунных заболеваний, D) демистификации гетерогенных Ответы на антиген специфические Т-клеток, или E) используют антиген специфические клетки для терапии. Инструмент основан на магнитных частиц, что мы конъюгат антиген специфические и Т-клеток co-stimulatory сигналов, и что мы термин как искусственные антиген представляющих клеток (aAPCs). Следовательно поскольку технология просто производить, он может легко быть принят другими лабораториями; Таким образом наша цель здесь заключается в том, подробно описать изготовления и последующего использования aAPCs. Мы объясняем, как прикрепить сигналы антиген специфические и co-stimulatory к aAPCs, как использовать их для обогащения для антиген специфические Т-клеток и как расширить антиген специфические Т-клеток. Кроме того мы будем освещать проектирование соображения на основе экспериментальных и биологической информации нашего опыта с характеризующие антиген специфические Т-клеток.
Introduction
С ростом многих immunotherapies необходимо уметь характеризовать и контроль иммунного ответа. В частности адаптивного иммунного ответа представляет интерес ввиду специфики и долговечность клеток. Недавно были утверждены химерных антиген рецепторов Т-клеточной терапии для лечения рака; Однако антиген рецепторы основаны покинуть общей ячейки поверхностного антигена CD19, вместо антигены, специфичные для рака1. За пределами специфичность immunotherapies могут также страдать от отсутствия контроля и ограниченное понимание динамических иммунный ответ в течение рака или аутоиммунных заболеваний.
Одна из задач изучения реакции антиген специфические является их крайне низкой частоты, например., антиген специфические Т-клетки являются 1 каждые 104 106 T клетки2,3. Таким образом расследовать какие T клетки присутствуют или отвечая, клетки необходимо либо обогащенный и расширена, или их сигнал должны быть усилены. Это дорого и сложно поддерживать с помощью текущих методов, направленных на расширение антиген специфические клетки клетки фидера. Существующие методы, которые сосредоточены на усиления сигнала антиген специфические T-клеток, как assay энзим соединенный immunospot (ELISPOT), ограничивать повторное использование этих клеток T4. Наконец из-за низкой чувствительностью, часто эти две техники нужно быть объединены для перечисления антиген специфические.
Для решения этих вопросов, мы разработали магнитных наночастиц на основе искусственного антиген представляющие клеток (aAPC)5,6,7,8. AAPC можно функционализированных с комплекс антиген специфические сигнал пептид загружен гистосовместимости (реализует) – и co-stimulatory молекул –например., антитела анти CD28-как обогатить антиген специфические Т-клеток и затем впоследствии стимулировать их расширение (рис. 1). Таким образом, частицы может быть экономически готовый продукт, который может быть как настроены для удовлетворения антиген специфические стимуляцию еще стандартизирована в эксперименты и пациентов. Выполнение на обогащение и расширение процесса результаты в сотни и тысячи раз расширение антиген специфические CD8 + Т-клеток и может привести к частоты до 60 процентов после всего за одну неделю, позволяя характеристика или терапевтического использования больших количество ячеек. Здесь мы опишем как сделать наночастиц aAPCs, некоторые критические дизайн соображения при выборе свойства наночастиц и продемонстрировать некоторые типичные результаты от использования этих частиц в изоляции и расширении редких антиген специфические CD8 + Т-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы создали технологии изоляции Роман антиген специфические Т-клеток, на основе наночастиц искусственного антиген представляющих клеток (aAPCs). Наночастицы aAPCs пептид загружены MHC на поверхности, что позволяет привязке антиген специфические Т-клеток и активации вместе с co-stimulatory активаци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. Спасибо NIH рака нанотехнологический центр обучения в институте Джонса Хопкинса нанобиотехнологии, национальной науки фонд исследовательских стипендий (DGE-1232825) и Дуг фонд поддержки стипендий. Эта работа финансировалась поддержке национальных институтов здравоохранения (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), ТЕДКО/Мэриленд инновационной инициативы и Фонд Коултер (ОСЗ).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
- Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
- Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
- Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
- Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
- , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
- Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
- Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
- Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
- Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
- Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
- Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
- Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
- Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
- Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).
