絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス
Summary
このプロトコルでは、高深度単一細胞 RNA 配列のため mRNA 転写に基づく増幅体外に続いて単一の蛍光に分類されたニューロンを分離するプロシージャを並べ替えマニュアルについて説明します。
Abstract
単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) 遺伝子発現を試金するため広く実装されているツールは、現在。市販の単一細胞 RNA シーケンス プラットフォームは無差別にすべての入力セルを処理します。時々、関心の特にラベル付きの人口を隔離する蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、上流に使用されます。FACS の制限は、収集およびマウス脳から希少またはまばらにラベル付けされた神経細胞集団をプロファイリングする非現実的です大幅ラベル付きの分数の入力セルの高数値の必要性です。ここでは、マウスの脳組織を分離した手動で収集スパースにたてから単一ニューロンを蛍光標識の手法について述べる。このプロセスにより、高純度と内生コピー比率を保持するの in vitro転写に基づく増幅プロトコルで統合単一標識細胞を取り込むため。ユニークな分子識別子 (Umi) を使用して個々 の mRNA の数を生成する二重線形増幅法について述べる。単一細胞あたりの遺伝子検出の高度の増幅結果の 2 つのラウンド。
Introduction
単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) は、トランスクリプトーム研究を変えてきました。ほとんどのメソッドは、定義済みのセルの種類を並べ替えることはできませんさまざまな液滴1、2マイクロ3nanogrids4マイクロウェル5などの技術を使用して大規模な単一セル RNAseq を実行できます。遺伝的コード化の同時を発現します。選択セル人口を隔離するには、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは単一セル モードでラベル付きセルを並べ替えるによく使用されます。ただし、FACS はいくつかの制限をあり、細心のサンプル処理手順が必要です。まず、入力セルの数が多いは通常、かなりの割合で (しばしば数百万セル mL あたり) を必要な (> 15-20%) ラベル付きの人口を含みます。第二に、細胞はグリア細胞分画、破片、およびノズルやフロー セルを詰まらせる可能性がありますそれ以外の場合細胞塊を削除する密度勾配遠心法手順を複数回を必要があります。第三に、FACS は通常染色と染め色ライブ/デッド (4 ′など6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、ヨウ化 propidium (PI)、Cytotracker 染料) を染色、追加の時間をとるための手順を採用します。第四に、2 色 (DAPI、赤/緑の蛍光蛋白質 (GFP/RFP) など)、並べ替えの通常 2 つのサンプルの 1 つの親指のルールは、必要に応じて必要なマウスの緊張だけでなく処理されるラベルのないサンプルを必要とします。第五に、フィルタ リングが実行されるは、複数回する前に、サンプルは、FACS マシンで詰まったサンプル線を予防するために並べ替え中に頻繁です。第六に、初期化し流体流を安定させるし、液滴の調整を実行する最も一般的に使用される FACS 設定で時間を割り当てる必要があります。サンプルは通常、実際のサンプル コレクション、早めに 6 と 7 の彼らの自身の手順を実行いずれかゲートなどのユーザーの設定や必要補償行列、ダブレット除去をセットアップする前にシーケンスで実行、コントロール、並列で技術者の支援します。最後に、ポスト FACS、しばしば単一ラベルだけ細胞が各井戸に存在することを確認する手順がありますたとえばで高速プレート撮像素子など高コンテンツ スクリーニング セットアップのサンプルをチェックします。
上記の手順を回避して比較的短時間で容易に単一の蛍光に分類されたニューロンの小さい人口のシーケンスを対象に述べる選別高感度体外の 2 ラウンドに続いて手順マニュアル絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) とダブルの生体外のトランスクリプションと呼ばれる増幅プロトコル。RNA 増幅と cDNA ライブラリを生成、Eberwineらから適応6 Hashimshonyら7、携帯電話より小さいボリュームを持つマウスの介在ニューロンに合わせて特定の変更さらに、興奮性錐体細胞に均等に有用であるまた発見しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルをソート マニュアルに適してまばら、人口マウス脳のラベルまたは現在のスループットの高いセルを用いた検討することですそれ以外の場合稀な細胞集団を代表しているニューロンのチャイルド RNA の塩基配列を解読並べ替えと増幅方法。通常 FACS を受ける細胞は ~ 9-14 psi、ノズルのサイズに応じての範囲で鞘とサンプルのライン圧力を受けるし、イベント レートを必要に応じて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、(5R01MH094705-04 と R01MH109665-01 Z.J.H.) NIH からの補助金、(Z.J.H.) に CSHL ロバートソン神経科学基金、(兼) に NARSAD ドクトラル ・ フェローシップにサポートされていました。
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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