단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의
Summary
이 프로토콜 수동을 정렬 mRNA 증폭 높은 깊이 단일 셀 RNA 시퀀싱 전사 기반 생체 외에서 다음 단일 붙일 레이블된 신경 세포를 분리 하는 절차에 설명 합니다.
Abstract
단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 지금 유전자 발현 시 금 한 널리 구현 된 도구 이다. 상업적으로 사용 가능한 단일 셀 RNA 시퀀싱 플랫폼 무차별 모든 입력된 셀 처리합니다. 때때로, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 관심의 구체적으로 레이블이 지정 된 인구를 분리 하 상류 사용 됩니다. FACS의 한계는 수집 하 고 쥐의 뇌에서 드문 또는 띄엄띄엄 레이블이 신경 인구를 프로 파일링에 대 한 실용적인 크게 레이블이 분수 입력된 셀의 높은 숫자에 대 한 필요는. 여기, 우리는 수동으로 수집 스파스 붙일 갓에서 단일 뉴런을 표시 해리 마우스 뇌 조직에 대 한 메서드를 설명 합니다. 이 프로세스는 높은 순도와 생체 외에서 전사 기반 증폭 프로토콜 생 성적 비율을 유지 하는 후속 통합 단일 레이블 뉴런을 캡처에 대 한 수 있습니다. 개별 mRNA 카운트를 생성 하기 위해 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하는 이중 선형 증폭 방법을 설명 합니다. 증폭 결과 단일 셀 당 유전자 검출의 높은 학위에서의 2 라운드.
Introduction
단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) transcriptomic 연구 변신 했다. 대규모 단일 셀 RNAseq 다양 한 방울1,2, 마이크로3, nanogrids4, microwells5와 같은 기술 사용 하 여 수행할 수 있지만 대부분 메서드 정의 된 셀을 정렬할 수 없습니다. 그 유전자 인코딩된 fluorophores를 표현 한다. 선택 세포 인구를 격리 하려면 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀 모드에서 레이블이 지정 된 셀을 정렬 하려면 종종 사용 됩니다. 그러나, FACS 몇 가지 제한 사항이 있으며 세심 한 샘플 처리 단계가 필요 합니다. 첫째, 입력된 셀의 많은 수는 일반적으로 상당한 분수 (종종 몇 백만 셀 mL 당), 필요 (> 15-20%) 레이블이 지정 된 인구를 포함 하. 둘째, 셀 준비 조밀도 기온 변화도 원심 분리 단계 폐해 분수, 파편, 및 그렇지 않으면 노즐 또는 흐름 셀을 방해할 수 있습니다 세포 덩어리를 제거 하의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다. 셋째, FACS 일반적으로 얼룩이 지 고 라이브/죽은 (예를 들어, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium 요오드 화물 (PI), 및 Cytotracker 염료) 얼룩, 추가 시간을 소요 하기 위한 단계를 destaining을 사용 합니다. 넷째, 엄지손가락의 규칙 2-색상 정렬 (예: DAPI 및 그린/레드 형광 단백질 (GFP/RFP)), 일반적으로 두 개의 예제 및 컨트롤은 필요에 따라 원하는 마우스 긴장 뿐만 아니라 처리 됩니다 레이블된 샘플을 요구. 다섯째, 필터링은 종종 수행 하기 전에 여러 번 샘플 FACS 기계에 막힌된 샘플 라인을 사전 방지 하기 위해 정렬 하는 동안. 여섯째, 가장 일반적으로 사용 되 FACS 설정을 초기화 하 고 유체 흐름을 안정화 고 방울 캘리브레이션을 수행에 시간을 할당 해야 합니다. 예제는 일반적으로 보상 행렬, 더블 릿 거부 설정, 중 문, 등 사용자 설정 단계 6과 7 스스로 미리 또는 필요에 대 한 실제 샘플 컬렉션 이전 순서 대로 실행 하는 7, 제어는 동시에 기술자의 지원입니다. 마지막으로, 포스트-FACS, 종종 하나의 분류에 셀에 각 잘; 있는지 확인 하는 단계는 예를 들어 빠른 판 영상 등이 콘텐츠 심사 설치에 샘플 검사 여.
위에서 설명한 단계를 우회 하 여 붙일 레이블이 단일 뉴런의 작은 인구의 시퀀싱을 대상으로 비교적 빠른 촉진 수동 절차 뒤에 매우 민감한 체 외 의 2 라운드 정렬 설명 증폭 프로토콜, 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 두 번 시험관 전사 라는. RNA 증폭 및 cDNA 라이브러리 생성은 Eberwine 그 외 여러분 에서 적응 6 와 Hashimshony 외. 7, 작은 세포 볼륨; 있는 마우스 수에 맞게 특정 수정 또한, 우리는 또한 흥분 성의 피라미드 뉴런에 대 한 동등 하 게 유용 하다 발견.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜을 정렬 매뉴얼은 인구 밀도 쥐 두뇌에서 표시 또는 현재 높은 처리량 셀을 사용 하 여 공부 가능 하지 않은 희소 한 세포 인구를 대표 하는 신경의 감독된 RNA 시퀀싱에 적합 정렬 및 증폭 방법입니다. FACS를 보통 복종 셀 노즐 크기에 따라 ~ 9-14 psi의 범위에서 칼 집 및 샘플 라인 압력을 받 다 고 원하는 이벤트 요금. 또한, 노즐에서 배출 되 고, 시 셀 수 토지 하드 컬렉션 튜브 또는 우물 영…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (5R01MH094705-04와 Z.J.H.에 R01MH109665-01)에서 교부 금에 의해, CSHL 로버트 슨 신경 과학 기금 (Z.J.H.)에 의해 고 NARSAD 장래가 화목 (되)에 의해 지원 되었다.
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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