Одноместный клеточной РНК последовательности нейронов дневно обозначенные мыши, с помощью ручной сортировки и двойной в Vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива Seq)
Summary
Этот протокол описывает ручной сортировки процедура изолировать одно дневно обозначенные нейронов, следуют в vitro на основе транскрипции мРНК усилители для высоких глубина одноклеточных РНК последовательности.
Abstract
Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) теперь является широко используемым инструментом для assaying экспрессии генов. Коммерчески доступных платформ одноклеточных РНК последовательности процесса всех входных клетки без разбора. Иногда активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) вверх по течению используется для изоляции специально обозначенные населения интерес. Ограничение СУИМ является необходимость большого числа ячеек ввода с значительно помечены фракций, которые нецелесообразно сбора и профилирование популяций редких или малонаселенных помечены нейрон от мозга мыши. Здесь мы описываем метод для вручную собирать разреженные дневно помечены одного нейроны от свежего отделить ткани мозга мыши. Этот процесс позволяет для захвата однокомпонентным нейронов с высокой чистоты и последующей интеграции с в vitro транскрипция на основе усиления протокол, который сохраняет эндогенного Стенограмма соотношения. Мы описываем двойной линейные усилители метод, который использует уникальные молекулы идентификаторы (UMIs) для создания индивидуальных счетчиков мРНК. Два раунда результатов амплификации в высокой степени обнаружения генов в одной ячейке.
Introduction
Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) превратил транскриптомики исследований. В то время как крупномасштабные одноклеточных RNAseq могут быть выполнены с использованием различных методов, таких как капельки1,2, микрофлюидика3,4nanogrids и microwells5, большинство методов нельзя сортировать типы определенных клеток Это Экспресс генетически закодированный флуорофоров. Чтобы изолировать население выделите ячейку, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) часто используется для сортировки помечены клетки в режиме одной ячейки. Однако СУИМ имеет некоторые ограничения и требует тщательной образца шаги обработки. Во-первых, большое количество ячеек ввода, как правило необходимо (часто несколько миллионов клеток / мл), значительная часть (> 15 – 20%) содержащий помечены населения. Во-вторых подготовка клетки может потребовать несколько раундов плотности градиентного центрифугирования шаги для удаления глиальных дроби, мусора и клеток сгустки, которые в противном случае может засорить сопла или потока ячейки. В-третьих СУИМ обычно работают, окрашивание и минигелей шаги для жить/мертвые окрашивание (например, 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), пропидий йодидом (PI) и Cytotracker красителей), которые занимают дополнительное время. В-четвертых как правило для сортировки (например, DAPI и зеленый/красный флуоресцирующий белок (GFP/ППП)), обычно два образца-двухцветный и один элемент управления необходимы, требующих немеченого образец должен обрабатываться в дополнение к желаемой мыши штамма. В-пятых фильтрация часто выполняется несколько раз до и во время пример сортировки proactively предотвратить засорение образец линии в машине СУИМ. В-шестых необходимо выделено время, в наиболее часто используемых настроек СУИМ для инициализации и стабилизировать потоком жидкости и калибровки капли. Седьмой, управления, образцы обычно выполняются в последовательности до фактической проб настроить компенсации матрицы, Дуплет отказ, либо установка ворот, пользователей и т.д. выполните шаги, шесть и семь себя раньше времени или требуют помощь специалиста параллельно. Наконец, пост СУИМ, часто есть шаги, чтобы обеспечить, что только надписью одной клетки присутствуют в каждой скважине; к примеру путем проверки пробы в высоким содержанием скрининг установки, такие как Быстрый плита тепловизор.
Обойти шаги, описанные выше и облегчения относительно быстро, целевые последовательности небольшой численностью населения одного дневно обозначенные нейронов, мы описываем ручной сортировки процедуры следуют два раунда высокочувствительный в пробирке амплификация протокол, называемый двойной in vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива-Seq). РНК амплификации и кДНК библиотеки поколения адаптированы из Eberwine и др. 6 и Hashimshony и др. 7, с некоторыми изменениями с учетом интернейронов мыши, которые имеют меньше сотовой томов; Кроме того мы также обнаружили, что это одинаково полезны для возбуждающих пирамидных нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Руководство, сортировка протокол подходит для поднадзорных РНК последовательности нейрона популяций, которые либо малонаселенных помечены в мозге мышей или представляют редкие клеток населения, которое иначе не возможно для исследования с использованием текущей ячейки высокой проп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержке грантов из низ (5R01MH094705-04 и R01MH109665-01-Z.J.H.), CSHL Робертсон нейронауки фонд (Z.J.H.) и NARSAD после стипендии (а.п.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
