石蜡包埋三维胶质瘤神经球培养的免疫组织化学评价胶质瘤生物标志物
Summary
作为3d 培养体生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。在这里, 我们提出了一个执行免疫组织化学的协议, 同时保持三维结构的胶质瘤神经球通过石蜡嵌入。这种方法可以描述胶质瘤神经球的性质, 如干细胞和神经分化。
Abstract
胶质瘤蛋白表达分析与胶质瘤病理学研究有关。许多蛋白质被描述为生物标志物, 在诊断、预后、分类、肿瘤进展状态和细胞分化状态等方面都有应用。这些生物标志物的分析也有助于表征胶质瘤患者和胶质瘤模型产生的肿瘤神经球 (ns)。肿瘤 ns 提供了一个有价值的体外模型来评估不同的特征, 从中获得, 并能更准确地反映胶质瘤生物学。在这里, 我们描述了一个详细的方法来分析生物标志物在肿瘤 ns 使用免疫组织化学 (ihc) 石蜡嵌入肿瘤 ns。
Introduction
胶质瘤是根据世界卫生组织1的表型和基因型特征分类的中枢神经系统的主要实体瘤。这种分类包括司机突变的存在或不存在, 这些突变代表了一个有吸引力的生物标志物来源 2。生物标志物是生物特性, 可以测量和评估, 以表明正常和病理过程, 以及药理反应的治疗干预3。生物标志物可以在胶质瘤的肿瘤组织和细胞中检测到, 使其能够在不同的方面进行生物表征。胶质瘤生物标志物的一些例子包括突变的异氰酸酯脱氢酶 1 (idh1), 这是一种与预后较好相关的低度胶质瘤的突变酶特征4。突变 idh1 常与 tp53 和α-地中海贫血综合征 x-连锁 (atrx) 失活突变结合表达, 定义了特定的胶质瘤亚型 4,5。atrx 失活突变也发生在44% 的儿童高级胶质瘤 2,6, 并已与攻击性肿瘤和基因组不稳定6,7。此外, 在组织内 h3 基因 h3f3a 或 hist1hb 基因 1, 6 中, 根据 k27m 突变的存在或不存在, 在亚组中对小儿弥漫性内脑桥胶质瘤 (dipg) 进行分化。因此, 分子特征的引入允许将胶质瘤作为单独的实体进行细分、研究和治疗, 这将更允许为每个亚型开发更有针对性的疗法。此外, 生物标志物的分析可用于评估不同的生物过程, 如凋亡8、自体吞噬9、细胞周期进展 10、细胞增殖11和细胞分化12.
基因工程动物模型, 窝藏人类癌症中存在的遗传病变是至关重要的信号路径的研究, 调解疾病的进展。我们的实验室已经实施了使用睡眠美容 (sb) 转相酶系统, 以开发基因工程小鼠模型的胶质瘤窝藏特定的突变, 重述人类胶质瘤亚型13,14。这些基因工程小鼠模型用于生成肿瘤衍生 ns, 使其能够在三维系统中进行体外研究, 反映了原位15肿瘤中存在的显著特征。此外, 将 ns 移植到小鼠体内可以产生继发性肿瘤, 这些肿瘤保留原发肿瘤的特征, 并模仿相应原发肿瘤15的组织病理学、基因组和表型特性。
在无血清培养中, 具有干细胞特性的脑肿瘤细胞可以得到丰富, 在表皮生长因子 (egf) 和成纤维细胞生长因子 (fgf) 的存在下, 它们可以作为单一细胞衍生的菌落 (如 ns 培养) 生长。在这种选择性培养系统中, 大多数分化或分化的细胞会迅速死亡, 而干细胞则分裂并形成细胞簇。这使得 ns 培养保持胶质瘤肿瘤的特点16,17,18。胶质瘤 ns 可用于评估肿瘤生物学的几个方面, 包括分析生物标志物, 在诊断, 预后, 分类, 肿瘤进展状态, 细胞分化状态, 细胞分化状态。在这里, 我们详细介绍了生成胶质瘤 ns 的协议, 并将3d 培养物嵌入石蜡中, 用于 ihc 染色。固定和嵌入胶质瘤 ns 的一个优点是, 与传统的细胞旋旋法相比, ns 的形态保持得更好,其中胶质瘤 ns 受到细胞离解的压力操纵, 并变得扁平。此外, 嵌入抑制任何内源性荧光体表达从基因工程肿瘤 ns, 使染色整个荧光光谱。该方法的总体目标是通过石蜡包埋过程保存胶质瘤细胞的三维结构, 并利用免疫组织化学对胶质瘤神经球进行表征。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文详细介绍了一种对石蜡嵌入胶质瘤 ns 进行免疫组织化学的通用和可重复的方法, 该方法保持了原位生长在大脑中的肿瘤细胞的特征三维结构。与使用镀金或塑料表面的细胞相比, 该技术具有以下优点: i) 保存 ns 的三维结构;ii) 在分析蛋白质表达之前, 避免细胞离解的应激;(iii) 从基因工程肿瘤 ns 中淬火任何内源性荧光体表达, 从而在荧光光谱中进行染色;和 iv) 长期储存。
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家健康研究所/国家神经疾病研究所的支持 & 中风 (nih/nnds) 赠款 r37-ns094804, r01 ns074387, r21-ns091555 至 m. g. c.;nhhninsd 赠款 r01-ns07691、r01-ns082311 和 r01 ns096756 至中华人民共和国;nhhxninsr01-eb022563;1uo1ca224160;神经外科;莉娅的快乐之心 m. g. c. 和 p. l.;和 rna 生物医学赠款 f046166 m. g. c. f. m. 由 f31 nhhxinds-f31 ns103500 支持。j. p. 得到了阿根廷富力体育和教育部研究金的支持。
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. 癌症研究. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
