הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד
Summary
Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.
Abstract
ניתוח של חלבון ביטוי glioma רלוונטי עבור מספר היבטים במחקר של הפתולוגיה שלו. חלבונים רבים תוארו גם סמנים ביולוגיים עם יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. ניתוחים אלה של סמנים שימושיים גם לאפיין הגידול neurospheres (NS) המופקים glioma חולים ומודלים glioma. הגידול NS מספקות מודל ערך במבחנה כדי להעריך את תכונות שונות של הגידול שממנו הם נגזרים, ניתן באופן מדויק יותר מראה glioma ביולוגיה. כאן נתאר שיטת מפורט לניתוח סמנים סרטניים NS באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) על גידול פרפין-מוטבע NS.
Introduction
Gliomas הם גידולים מוצקים העיקרי של מערכת העצבים המרכזית מסווגים לפי המאפיינים שלהם פנוטיפי ו genotypic על פי ארגון הבריאות העולמי ה-1. סיווג זה משלבת נוכחות או היעדרות של מוטציות הנהג, אשר מייצגים מקור אטרקטיבי של סמנים ביולוגיים2. סמנים ביולוגיים הן תכונות ביולוגיות ולהשוואה הערכה לציון תהליכים נורמליים ופתולוגיים, כמו גם תרופתי התגובות התערבות טיפולית3. סמנים ביולוגיים ניתן להבחין ב גידול רקמות ותאים שמקורם glioma, המאפשרת אפיון ביולוגי שלו בהיבטים שונים. כמה דוגמאות של סמנים ביולוגיים glioma כוללים מוטציה isocitrate דהידרוגנאז 1 (IDH1), אנזים מוטציה האופייניים gliomas נמוך בכיתה הקשורים עם פרוגנוזה טובה יותר4. מוטציה IDH1 מתבטא לעתים קרובות בשילוב עם TP53 אלפא-תלסמיה/מנטלי פיגור תסמונת X-linked (ATRX)-inactivating מוטציות, הגדרת glioma ספציפי של סוג הנכס4,5. מוטציות ATRX inactivating גם להתרחש ב- 44% של ילדים gliomas בדרגה גבוהה2,6 , קושרו עם גידולים אגרסיביים, אי יציבות גנומית6,7. בנוסף, ילדים ‘ מאטום לשקוף ‘ מהותי pontine gliomas (DIPG) מובחנים של תת קבוצות לפי נוכחות או היעדרות של מוטציה K27M בגן היסטון H3 H3F3A, או ב- HIST1H3B/C ג’ין1,6. לכן, כניסתה של אפיון מולקולרי מתיר את חלוקת משנה, מחקר, וטיפול של gliomas כישויות נפרדות, אשר יותר יאפשר הפיתוח של יותר ממוקד טיפולים עבור כל סוג של. בנוסף, הניתוח של סמנים ביולוגיים ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכים ביולוגיים שונים כגון אפופטוזיס8, autophagy9, מחזור התא התקדמות10, התפשטות תא11תאית התמיינות12 .
בדגמי בעלי חיים מהונדסים גנטית הנמל נגעים גנטי נוכח סרטן אנושיים הם קריטיים עבור המחקר של איתות המסלולים המתווכות התקדמות המחלה. המעבדה שלנו יישמה את השימוש במערכת transposase היופי ישן (SB) לפתח מודלים מהונדס גנטית עכבר של glioma מחסה מוטציות ספציפיות אשר מסכם את הדברים glioma האנושי יחוברו13,14. מודלים מהונדס גנטית עכבר אלה משמשים ליצירת NS נגזר הגידול, אשר מאפשרים מחקרים במבחנה במערכת תלת-ממד, תכונות בולטות שיקוף להציג גידולים מקומיים בתוך15. כמו כן, השתלת orthotopical של NS לתוך עכברים ניתן להפיק גידולים משניים אשר שומרים על תכונות של הגידול העיקרי ומחקים את המאפיינים histopathological גנומית, פנוטיפי של הגידול העיקרי המקביל15.
בתרבות ללא סרום, תאים סרטניים במוח עם מאפייני תא גזע יכולים להיות מועשר, בנוכחות גורמי גדילה עוריות (EGF) ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGF), הם ניתן לגדל כמו מושבות נגזר תא יחיד כגון NS תרבויות. במערכת זו בררני תרבות ‘, רוב התאים המבדילים או הבדיל במהירות מתים, ואילו תאי גזע להתחלק ויוצרים האשכולות הסלולר. פעולה זו מאפשרת את הדור של תרבות NS המתחזק glioma הגידול תכונות16,17,18. Glioma NS ניתן להעריך כמה היבטים של הגידול ביולוגיה, כולל הניתוח של סמנים ביולוגיים בעלי יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירה glioma NS להטביע את התרבויות 3D פרפין לשימוש עבור IHC מכתים. אחד היתרונות של תיקון והטבעה glioma NS הוא כי המורפולוגיה של NS נשמר טוב יותר בהשוואה ל- cytospin המקובלת בשיטה19, אילו glioma NS מוכתבת עליהם מניפולציה מלחיץ עבור תא דיסוציאציה, להיות שיטוח. בנוסף, הטבעה המרווה כל ביטוי fluorophore אנדוגני מהגידול מהונדס גנטית NS, המאפשרים צביעת על פני ספקטרום פלורסנט. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשמר את המבנה התלת-ממד של תאים glioma דרך פרפין הטמעת תהליך אפיון של glioma neurospheres באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנחנו פירוט שיטה לשחזור רב-תכליתי לביצוע אימונוהיסטוכימיה על glioma פרפין-מוטבע NS, המקיימות המבנה 3D האופיינית של תאים סרטניים גדל המוח בתוך באתרו. טכניקה זו יש את היתרונות הבאים לעומת באמצעות תאי ציפוי זכוכית או משטחי פלסטיק: אני) שימור המבנה התלת-ממד של NS; ii) הימנעות של מתח התא ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות & קו (NIH/NINDS) מענקים R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 כדי M.G.C.; NIH/NINDS מעניקה R01-NS076991 R01-NS082311, R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; במחלקה הנוירוכירורגית; לבבות שמח של לאה M.G.C., P.R.L.; והיא RNA וההתערבות גרנט F046166 כדי M.G.C. F.M.M. נתמכת על ידי F31 NIH/NINDS-F31NS103500. ג’יי. פי נתמכה על ידי משרד הספורט פולברייט-ארגנטינאי מלגת החינוך.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. 癌症研究. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
