Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen
Summary
Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.
Abstract
Analyse van de eiwituitdrukking in glioma is relevant voor de verschillende aspecten in de studie van de pathologie. Talrijke proteïnen zijn beschreven als biomarkers met toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat. Deze analyses van biomarkers zijn ook handig voor het karakteriseren van de tumor neurospheres (NS) gegenereerd op basis van glioma patiënten en glioma modellen. Tumor NS bieden een waardevolle in vitro model voor de beoordeling van de verschillende kenmerken van de tumor waaruit ze zijn afgeleid en kan nauwkeuriger spiegel glioma biologie. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om biomarkers in tumor NS te analyseren met behulp van immunohistochemistry (IHC) op paraffine-ingebedde tumor NS.
Introduction
Gliomas zijn primaire solide tumoren van het centrale zenuwstelsel door hun fenotypische en genotypische kenmerken volgens de World Health Organization1ingedeeld. Deze indeling bevat de aanwezigheid of afwezigheid van bestuurder mutaties, die een aantrekkelijke bron van biomarkers2 vormen. Biomarkers zijn biologische kenmerken die kunnen worden gemeten en geëvalueerd om aan te geven van de normale en pathologische processen, evenals farmacologische reacties op een therapeutische interventie3. Biomarkers kunnen worden opgespoord in de tumor weefsel en cellen afgeleid van glioma, waardoor haar biologische karakterisering in verschillende aspecten. Enkele voorbeelden van glioma biomarkers gemuteerde isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), een mutant enzym die kenmerkend zijn voor lager-grade gliomen betere prognose4is gekoppeld. Gemuteerde IDH1 wordt vaak uitgedrukt in combinatie met TP53 en alpha-thalassemie/mentale retardatie syndroom X-gebonden (ATRX)-inactiveren mutaties, vaststelling van een specifieke glioma subtype4,5. ATRX-inactiveren mutaties ook optreden in 44% van de pediatrische hoogwaardige gliomen2,6 en zijn geassocieerd met agressieve tumoren en instabiliteit van het genoom6,7. Daarnaast worden de pediatrische diffuus intrinsiek pontine gliomen (DIPG) onderscheiden in subgroepen volgens de aanwezigheid of afwezigheid van een K27M mutatie in gen H3F3A H3 Histon, of in de HIST1H3B/C gen1,6. Derhalve de invoering van moleculaire karakterisering vergunningen de Subdivisie studie en de behandeling van gliomen als afzonderlijke entiteiten, waardoor de ontwikkeling van meer meer gerichte therapieën voor elk subtype. Bovendien, kan de analyse van biomarkers worden gebruikt om te evalueren van de verschillende biologische processen zoals apoptosis8, autophagy9, celcyclus progressie10, cel proliferatie11en celdifferentiatie12 .
Genetisch gemanipuleerde dierlijke modellen die de genetische laesies aanwezig in menselijke kankers haven zijn essentieel voor de studie van signalering van trajecten die bemiddelen van progressie van de ziekte. Ons laboratorium heeft het gebruik van het Sleeping Beauty (SB) transposase systeem voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde Muismodellen van glioma herbergen specifieke mutaties die menselijke glioma subtypen13,14recapituleren geïmplementeerd. Deze genetisch gemodificeerde Muismodellen worden gebruikt voor het genereren van tumor-afgeleide NS, waarmee in vitro studies in een 3D systeem, mirroring salient eigenschappen presenteren in de tumoren in situ15. Ook kan de transplantatie van de orthotopical van NS in muizen secundaire tumoren die functies van de primaire tumor behouden en bootsen de histopathologische genomic en fenotypische eigenschappen van de overeenkomstige primaire tumor15genereren.
In serumvrij cultuur, tumor hersencellen met eigenschappen van de cel van de stam kunnen worden verrijkt en in aanwezigheid van epidermale groeifactoren (EGF) en fibroblast groeifactoren (FGF), kunnen ze worden geteeld als één cel-afgeleide kolonies zoals NS culturen. In dit systeem van selectieve cultuur sterven meeste onderscheidende of gedifferentieerde cellen snel, overwegende dat stamcellen verdelen en vormen van de cellulaire clusters. Hierdoor is de generatie van een NS-cultuur die glioma tumor functies16,17,18 onderhoudt. Glioma NS kan worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie van de tumor, met inbegrip van de analyse van biomarkers die toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat hebben. Hier, we detail een protocol voor het genereren van glioma NS en de 3D culturen inbedden in paraffine worden gebruikt voor de kleuring van IHC. Een voordeel van vaststelling en glioma NS insluiten is dat de morfologie van de NS beter wordt gehandhaafd ten opzichte van de conventionele cytospin methode19, in welke glioma NS worden stressvolle manipulatie voor cel dissociatie en worden afgevlakt. Bovendien lest insluiten een endogene fluorophore expressie van genetisch gemanipuleerde tumor NS, waardoor over de fluorescerende spectra kleuring. Het algemene doel van deze methode is om te behouden de 3D structuur van glioma cellen door een proces te embedding paraffine en karakterisering van glioma neurospheres met behulp van immunohistochemie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel, we in detail te beschrijven een veelzijdige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van immunohistochemistry op paraffine-ingebedde glioma NS, die houden van de karakteristieke 3D structuur van tumorcellen in de hersenen in situgroeien. Deze techniek beschikt over de volgende voordelen ten opzichte van cuvetten verguld op glas of kunststof oppervlakken: ik) behoud van de 3D structuur van NS; II) voorkomen van stress van cel dissociatie vóór de analyse van eiwit expressie; III) het blussen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; de Afdeling Neurochirurgie; De Happy Hearts Leahs M.G.C. en P.R.L.; en RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. werd gesteund door een Fulbright-Argentijnse ministerie van sport en onderwijs Fellowship.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. 癌症研究. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
